慢病毒感染效率低其实很常见，基本都能通过排查一步步拉上来。
一、先确认：到底“低”到什么程度？
在动手改条件前，先确认这几点（很多人卡在这一步）：
🔬 用什么指标判断感染效率？
- 荧光表达率（流式 / 显微镜）
- qPCR（整合拷贝数）
- Western / 功能表型
有些基因表达慢，48 h 看不到不代表没感染（尤其是弱启动子、分泌蛋白、转录因子）。
二、最常见的 8 个原因 & 对应解决方案
1️⃣ MOI 不够（最常见）
问题：MOI 设得太保守
解决：
-
直接做 MOI 梯度：5 / 10 / 20 / 50
-
如果是难感染细胞（原代、悬浮、干细胞），MOI 20 起步
⚠️ 不要只用一个 MOI 就下结论
2️⃣ 病毒滴度虚高或失活
问题来源：
-
滴度是 p24 / RNA copy，不是功能滴度
-
病毒反复冻融
-
保存温度不对
解决：
-
尽量用 功能滴度（TU/mL）
-
病毒 −80°C 分装保存，一次一管
-
融化后 1–2 小时内用完
3️⃣ 细胞状态不好（比你想的更重要）
典型情况：
-
细胞过密 / 过稀
-
刚复苏
-
分化中 / 应激状态
解决：
-
贴壁细胞：感染时 30–50% 融合度最佳
-
感染前至少 稳定传代 1 次
-
确保无支原体（这个真的很致命）
4️⃣ 没加（或没加好）Polybrene
问题：
-
没加
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浓度太低
-
细胞对 Polybrene 不敏感
解决：
-
常用 4–8 μg/mL
-
若毒性大，可试：
-
Protamine sulfate（5–10 μg/mL）
-
或短时间孵育后换液
-
5️⃣ 感染时间太短 / 换液太早
建议：
-
病毒作用 6–12 h（有些细胞 24 h 更好）
-
不是必须 6 h 就换液
-
可试 两次感染（Day 0 + Day 1）
6️⃣ 启动子不适合这个细胞（常被忽略！）
| 启动子 | 适合 |
| CMV | 常规细胞，但在部分原代/干细胞中易沉默 |
| EF1α | 原代、干细胞更稳 |
| PGK | 表达弱但稳定 |
| SFFV | 高表达，但部分细胞毒性 |
7️⃣ 目的基因对细胞有毒
表现：
-
早期有荧光，后期消失
-
细胞大量死亡
解决：
- 改用弱启动子
- Tet-on 诱导系统
- 低 MOI + 药筛富集
8️⃣ 细胞本身就是“难搞型”
比如：
-
原代 T 细胞 / B 细胞
-
巨噬细胞
-
干细胞
策略：
-
提高 MOI
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离心感染（Spinfection，800–1200 g，30–90 min）
-
更换假型（如 VSV-G 已是最优，但仍要结合条件）
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