AAV三质粒包装系统

AAV 三质粒包装系统（triple plasmid system）是目前最常用、最成熟的重组 AAV（rAAV）体外包装方式，主要用于科研级和临床前级 AAV 病毒制备。

一、三质粒分别是什么？

1.转移质粒（Transfer plasmid / Vector plasmid）

作用：携带你真正想递送的目的基因。

核心元件：

• 5′ ITR + 3′ ITR（AAV2 ITR 最常见）

• 启动子（CMV、CAG、hSyn、U6 等）

• 目的基因（GOI）/ shRNA / sgRNA

• polyA 信号

注意：ITR 是 AAV 能被复制和包装的唯一必要顺式元件，其他部分不会被包装进病毒。

2.包装质粒（Rep/Cap plasmid）

作用：提供 AAV 的结构和复制相关蛋白。

包含基因：

• rep：负责 AAV 基因组复制与包装

• cap：决定 AAV 血清型和组织嗜性（如 AAV2/8/9、PHP.eB 等）

要点：

• cap 决定你最后拿到的 AAV 血清型

• rep 通常来自 AAV2

3.辅助质粒（Helper plasmid）

作用：提供腺病毒辅助功能，使 AAV 能在 HEK293 等细胞中高效复制。

常见基因：

• E2A

• E4

• VA RNA
  （不含 E1，E1 由 293 细胞自身提供）

安全性关键点：这些基因不被包装进 AAV 病毒。

二、三质粒系统是怎么工作的？

在 HEK293 / 293T 细胞中：

1.三个质粒按一定比例共转染

2.helper 基因启动 AAV 复制环境

3.rep 复制转移质粒中的 ITR 区段

4.cap 组装衣壳并完成基因组包装

5.形成无复制能力的重组 AAV 病毒

三、为什么三质粒系统最常用？

• 安全性高：无野生型 AAV 产生
• 灵活性强：快速更换血清型或表达盒
• 体系成熟：工艺稳定、文献和 SOP 丰富
• 适用面广：过表达 / RNAi / CRISPR / Cre 等

四、常见应用场景

• 基因过表达（OE）

• 基因敲低（shRNA / miRNA）

• 条件性敲除（AAV-Cre）

• CRISPR 基因编辑（sgRNA + Cas9 分体）

• 动物模型构建（中枢 / 肝脏 / 肌肉等）

五、客户常问的几个点（FAQ 简答）

Q：三质粒比例一般是多少？
A：常见 1 : 1 : 1（也有 1 : 1 : 2，需根据体系优化）

Q：会不会产生复制型 AAV？
A：正常情况下不会，rep/cap 与 ITR 分离，安全性高

Q：可以用于 GMP 吗？
A：工艺本身可用于 GMP，需配合 GMP 级质粒和生产体系