AAV大基因递送：突破4.7kb容量限制的拆分策略

腺相关病毒（AAV）是目前基因治疗领域应用最广泛的病毒载体之一。凭借其低免疫原性、高转导效率以及在多种组织中实现长期稳定表达的能力，AAV已在基础研究和临床转化中取得了令人瞩目的进展——从早期获批的 AAV 基因治疗药物Glybera，到 Luxturna、Zolgensma 等里程碑式产品，AAV 的临床价值正在被不断验证。

然而，AAV 有一个几乎无法回避的物理限制——约 4.7 kb 的基因组包装容量。这一上限需要容纳目的基因编码序列（CDS）、启动子、增强子、poly(A) 信号序列以及病毒包装必需的反向末端重复序列（ITR，约 145 bp × 2）。当目的基因的 CDS 本身接近甚至大幅超过 4 kb 时，单个 AAV 载体便力不从心。

这并非小概率问题——许多重要遗传疾病的致病基因恰恰”超标”。以杜氏肌营养不良（DMD）为例，其 DMD 基因全长 cDNA 约 11 kb；DFNB9 型耳聋的致病基因 OTOF 约 6 kb；Stargardt 病的 ABCA4 基因约 6.8 kb。容量瓶颈，直接将这些疾病挡在了 AAV 基因治疗的”门外”。

面对这一挑战，研究者们开发出了一系列将大基因”化整为零、再聚为一”的双载体（或多载体）递送策略。本文将为您系统梳理这些策略的设计原理，各自的优缺点，并结合经典的应用案例，为您提供一份详尽的AAV大基因递送实战参考指南。

一、破“限”之道：大基因拆分与重组的核心技术策略

面对“超载”的基因货物，科学家们开发了多种巧妙的“拆分-重组”策略，其核心思想是将一个大基因拆分成两个或多个片段，分别包装进不同的AAV病毒中，在共感染目标细胞后，通过DNA重组、mRNA反式剪接或蛋白质内含肽剪接三种不同层面的分子机制，将这些基因片段重新拼接成一个完整的、具有功能的表达单元。

1. 重叠法 (Overlapping / Homologous Recombination) [1-2]

这是最早被开发也是最经典的双载体策略之一。

设计原理：将大基因从中间拆分为两部分，上游载体包含启动子和基因 5′ 片段，下游载体包含基因 3′ 片段和 poly(A)信号，分别构建到两个AAV载体上。关键在于，这两个载体的拆分区存在一段几百bp的同源重叠序列（overlapping sequence）。

重组机制：当这两个AAV载体共感染同一个细胞并进入细胞核后，细胞会利用自身的同源重组修复机制，以重叠序列为模板，将两条AAV基因组拼接成一个完整的、可转录的DNA分子（图1）。

优点：

• 概念简单，易于设计，无需引入额外的外源功能元件。
• 重组后的产物是完整的DNA，可以实现长期稳定的表达。

挑战：

• 重组效率偏低：依赖于细胞内源的同源重组，其效率在不同组织和细胞类型中差异很大，且通常不高。
• 副产物问题：可能产生非同源末端连接（NHEJ）介导的副产物或单体截短蛋白，可能引发细胞毒性或免疫反应。

图1 重叠法(Overlapping)双AAV载体递送策略[1]

2. 经典 dual-AAV trans-splicing：先重建载体，再重建转录本[1,3]

为了克服同源重组效率低下的问题，研究者们将目光投向了更为高效的mRNA剪接过程。

设计原理：将过大的基因表达盒拆分为两个独立的AAV载体。

• 5’端载体（上游载体）：携带启动子（Promoter）、5’端编码序列（5′ CDS）以及位于3’端的剪接供体位点（Splice Donor, SD）。
• 3’端载体（下游载体）：携带剪接受体位点（Splice Acceptor, SA）、3’端编码序列（3′ CDS）以及多聚腺苷酸信号（PolyA）。

两个载体通过ITR（反向末端重复序列）介导的分子间重组进行头尾相连（head-to-tail concatemerization），形成完整的转录单元（图2）。

重组机制：两个AAV基因组的ITR序列通过分子间重组实现头尾相连，连接后，SD和SA信号识别并剪切除去中间的重组ITR序列，剪接后产生包含完整编码序列的单一mRNA分子，随后翻译成全长蛋白（图2）。

图2 反式剪接(Trans-splicing)双AAV载体递送策略[1]

优点：

• 明确的分子机制：相比重叠法的策略，dual-AAV trans-splicing具有更明确的分子机制，通过工程化的剪接信号精确控制重组过程。
• 广泛适用性：不依赖于基因内部的同源序列，可适用于各种大型基因。
• 背景表达低：单个载体表达的将是无功能的截短蛋白，降低了背景信号和潜在毒性。

挑战：

• 方向性依赖：需要两个载体以特定的头尾方向连接，随机连接效率低。
• 剪接效率问题：需要精确的剪接信号匹配，剪接效率可能影响最终蛋白产量。
• 共转导要求：需要目标细胞同时被两个载体感染，对共转导效率要求高。
• 组织/细胞类型差异：不同组织的DNA修复和剪接机制差异可能影响效率。

3. REVeRT：真正意义上的 mRNA反式剪接（trans-splicing）[4-5]

REVeRT (Reconstitution via mRNA Trans-splicing)：通过 mRNA反式剪接在转录本层面重建完整大基因或大型编辑工具。该体系已被用于重建报告基因、CRISPRa、prime editor 以及大基因 ABCA4，并在细胞、类器官和小鼠体内得到验证 (图3) 。

设计原理：将过大的基因表达盒拆分为两个独立AAV载体，但与传统依赖DNA层面连接的双AAV不同，REVeRT的核心在于RNA层面的重建。

• 5’端载体（上游载体）：携带启动子、5’端编码序列、剪接供体位点（SDS）、互补结合域（binding domain）以及polyA等元件。
• 3’端载体（下游载体）：携带启动子、互补结合域、剪接受体位点（SAS）、3’端编码序列以及polyA信号。

两个载体进入同一细胞后，分别转录形成两段RNA，这两段RNA借助互补结合域靠近，再在SDS和SAS的介导下发生真正的mRNA反式剪接，生成完整成熟mRNA，最终翻译出全长蛋白。

重组机制：

REVeRT的重组过程主要发生在两条独立mRNA之间，而不是先在AAV基因组的DNA层面完成重组。具体来说，两个AAV分别转录产生5’片段RNA和3’片段RNA，这两条RNA在互补结合域的作用下相互配对并靠近，随后由细胞剪接机制识别剪接供体位点（SDS）和剪接受体位点（SAS），切除中间非编码序列并完成反式剪接，最终形成包含完整编码序列的成熟mRNA，再进一步翻译生成全长蛋白。

图3   REVeRT法双AAV载体递送策略[4]

优点：

• 不依赖DNA同源重组，机制更直接：REVeRT主要依赖mRNA反式剪接完成重建，而不是依赖效率有限的DNA层面重组，因此在原理上绕开了传统DNA trans-splicing效率不稳定的问题。
• 应用范围广：该体系不仅能重建报告蛋白，还能用于 CRISPRa、prime editing、体内多重编辑（同时激活和敲除）以及大基因补充治疗。
• 体内外均具有可观重建效率。

挑战：

• 仍然依赖双载体共转导：REVeRT必须要求同一目标细胞同时获得两个AAV载体，之后两条RNA才能发生trans-splicing。因此在体内尤其是系统给药条件下，共转导效率仍然是限制因素。
• 重建效率仍未达到单载体全长表达水平：虽然REVeRT能实现功能性恢复，但其效率通常仍低于全长单载体对照，例如luciferase在体内和类器官中的恢复都只是部分比例，提示该系统仍需进一步优化。
• 系统对剪接元件设计较敏感：SAS对效率影响尤其显著，不同SAS之间差异很大；互补结合域、是否保留polyA、split site选择等也都会影响结果。这说明REVeRT虽然灵活，但并不是完全“即插即用”，仍需针对不同目标进行工程优化。

4. Hybrid AK：把“重组”和“剪接”组合起来[1]

将”大基因递送”从传统依赖ITR随机串联的低效重组，升级为依赖外源性高重组原性序列（AK）介导的高效同源重组的”定向拼接”。

设计原理：

Hybrid AK的核心设计是把完整表达盒拆成两个携带互补AK重组臂的AAV载体（图4）：

• AAV-5’载体：携带启动子与目标基因（GOI）5’端片段，并在末端依次连接剪接供体位点（SD）与AK重组序列（F1噬菌体来源，77bp）， flank以ITR，形成”重组臂+剪接信号”的双重功能模块。
• AAV-3’载体：携带AK重组序列（与5’载体互补）、剪接受体位点（SA）、GOI 3’端片段和poly(A)信号，AK-SA-GOI-3’序列位于ITR之间，确保重组后形成完整转录单元。
• 关键设计：AK序列作为外源性重组原性区域，不依赖GOI内部序列同源性，使拆分位点选择更灵活；SD/SA信号嵌套于AK序列两侧，确保DNA重组后通过顺式剪接精确去除重叠区。

重组机制

该双AAV载体系统通过共感染实现目标基因（GOI）的高效重建（图4）：

• AK序列启动重组：共感染后，两个载体通过AK序列介导的分子间同源重组，将5’载体的”Promoter-GOI-5′-SD-AK”与3’载体的”AK-SA-GOI-3′-poly(A)”精确拼接，形成单一连续DNA分子。
• mRNA成熟与翻译：重组后的DNA转录为pre-mRNA，包含SD-AK-SA内含子结构，经顺式剪接去除AK序列及连接区，生成可翻译的成熟GOI转录本。
• 方向性控制：AK重组序列显著提高头尾串联（head-to-tail）正确方向的比例，减少错误串联导致的表达失败。

优点

• 重组效率更高、方向性更强：AK序列的高重组原性显著优于单纯ITR介导的随机串联。
• 适用范围更广：不依赖GOI内部同源序列，可通用化设计。

挑战

• 共感染门槛仍在：双载体系统本质上依赖同一细胞同时获得两个AAV；组织/血清型/剂量分布不均会限制总体有效细胞比例。
• 组织特异性差异：不同细胞的DNA修复通路活性影响重组效率。
• 血清型组合优化：AAV血清型与靶组织的匹配对共转导效率影响显著。

图4 AK法双AAV载体递送策略[1]

 

5. Split intein：在蛋白层面完成“无缝拼接”[6]

如果说前两种策略依赖的是细胞自身的“剪刀加浆糊”，那么内含肽策略则是为蛋白片段引入了能“自我重组”的智能模块。

设计原理：内含肽（Intein）是一类特殊的蛋白质序列，能够从一个前体蛋白中自我“剪切”出去，并同时将两侧的“外源蛋白”（Extein）通过标准的肽键连接起来。分裂内含肽（Split-Intein）则是将一个内含肽拆分成N端（IntN）和C端（IntC）两部分。我们将大蛋白拆分成两半，分别与IntN和IntC融合，并由两个AAV载体递送（图5）。

重组机制：当两个融合蛋白在细胞内相遇时，IntN和IntC会自动识别、折叠并缔合，恢复内含肽的完整功能，然后催化自身切除，并将两侧的目标蛋白片段无痕地连接在一起，形成全长功能蛋白。

优点：

• 反应快速、效率高：蛋白质剪接过程非常迅速，例如常用的Npu DnaE和 Rma DnaB 内含肽，其反应半衰期可达秒级。
• 绕开转录和剪接：直接在蛋白质层面操作，不受转录效率、mRNA稳定性等因素影响。
• “无痕”连接：理想情况下，连接处不引入任何额外的氨基酸。

挑战：

• 剪接效率：部分内含肽系统存在不完全剪接的问题，可能与蛋白折叠、聚集有关。
• 拆分位点选择：拆分位点的选择对目标蛋白的折叠和功能至关重要，需要仔细评估。
• 免疫原性：内含肽作为外源蛋白，存在引发免疫反应的潜在风险。

图5 内含肽双AAV载体递送策略[6]

6. AAVLINK技术: 新近出现的位点特异性重组路线[7]

将“大基因递送”从传统依赖同源重叠的 DNA自发拼接，升级为依赖 Cre/lox 位点特异性重组的“强制拼接”。

设计原理：

AAVLINK 的核心设计是把完整表达盒拆成两个彼此“单独不完整、合在一起才完整”的 AAV（图6）：

• AAV-5’载体：携带启动子与目标基因（GOI）5’端片段，并在末端加入剪接供体位点（SD）与一个 lox 位点，同时刻意不提供有效 poly(A)，使其单独进入细胞时难以形成稳定表达。
• AAV-3’载体：放入启动子驱动的 Cre 重组酶表达框，并在一个人工内含子里嵌入另一个 lox 位点，在其后依次连接剪接受体位点（SA）、GOI 3’端片段和 poly(A)，其中一个关键技巧是把 GOI 的 3’片段“隐藏”在 Cre 的 3’UTR/内含子结构之后，让重组前更像非完整表达盒。
• AAVLINK系统还可扩展至三载体配置，进一步突破载体容量限制。通过合理设计多个lox位点和剪接位点的组合（图7），三载体AAVLINK系统能够递送高达11kb的遗传物质，这几乎涵盖了大多数与人类遗传疾病相关的大基因。在三载体系统中，基因被分割成三个片段分别装载，通过Cre介导重组和剪接过程，最终重建完整的功能基因表达单元。
• 为进一步降低重组的可逆性，系统通常采用左右臂突变的非对称 lox（LE/RE）配对，使重组后生成难以再次被 Cre 识别的双突变位点，从而让拼接更趋于不可逆。

重组机制：

该双AAV载体系统（或三载体系统）通过共感染实现目标基因（GOI）的条件性表达（图6-7）：

Cre酶启动重组：共感染后，3’载体首先表达Cre重组酶。

分子间基因重建：Cre酶识别并介导载体间loxP位点的分子间重组，将各载体携带的基因片段精确拼接，形成一个完整的转录单元。

mRNA成熟与翻译：重组后的DNA转录为前体mRNA，随后通过SD/SA介导的剪接反应去除人工内含子，生成可翻译的成熟GOI转录本。

自我失活的安全开关：重组过程会使Cre编码序列与其表达所必需的SA/poly(A)元件分离，导致Cre在完成重组任务后表达迅速终止。这种瞬时表达策略，显著降低了长期表达可能带来的脱靶或免疫风险。

图6 AAVLINK系统示意图。对于双AAV载体方案，其中一条载体携带GOI的5′端部分，并在其末端加入SD（剪接供体）等元件，但缺乏poly(A)信号；另一条载体包含Cre重组酶表达框及相关UTR，并将GOI的3′端片段（连同SA，剪接受体）布置在Cre转录单元的下游/非完整表达盒结构中。重组发生前，只有Cre因具备完整表达盒而更易被表达[7]。

图7 AAVLINK介导的三载体递送示意图。在三载体（tripartite）方案中，需要使用两对lox位点来组装被分段拆分的GOI。第一对lox位点（loxJT15 与 loxJTZ17）介导GOI 5′端片段与GOI主体（body）片段之间的重组；随后，GOI的3′端片段通过另一对间隔/突变型lox位点（lox2272-JT15 与 lox2272-JTZ17）发生重组，从而被转位并连接到GOI主体片段的下游[7]。

 

优点：

• 重组效率更高、可控性更强：由Cre/lox驱动的位点特异性重组通常比细胞内源同源重组更稳定、更高效。

• 副产物更少：通过“5’端无poly(A)+带SD抑制成熟”“3’端把GOI-3’放在Cre之后且需经重组+剪接才变成表达盒”，能显著降低传统双AAV常见的截短蛋白/错误拼接产物。

• 拆分位点更灵活：不再强依赖几百bp同源重叠序列，拆分策略可围绕剪接与载体容量做更灵活优化。

• 载体容量突破：三载体系统可递送高达11kb的遗传物质，覆盖绝大多数大基因治疗需求。
• 表达更干净、Cre更短暂：重组后GOI是“完整DNA表达盒”，可获得较长期表达；同时Cre在完成重组后被“自我关停/显著衰减”，有利于安全性。

挑战：

• 共感染门槛仍在：多载体系统本质上依赖同一细胞同时获得所有AAV载体，组织/剂量/血清型分布不均会限制总体有效细胞比例。

• Cre相关安全性与免疫风险：Cre属于外源蛋白，存在潜在毒性或免疫原性；也可能在极端情况下带来非预期重组风险，因此文章中进一步提出了 AAVLINK2.0（如用降解标签使Cre更易降解）来缓解生物安全顾虑。

• 工艺与质控复杂度增加：需要多种载体分别生产、定量、配比与一致性控制；临床级放大时对批间差异更敏感。

7. 其他创新策略

三 AAV 载体系统（Triple AAV） 是一种面向超大基因的容量扩展策略：如果把单个 AAV 理解成一个“快递盒”，那它最大的难题就是空间太小：很多真正关键的疾病基因，根本装不进去。像 DMD 这样的超大基因，全长编码序列超过 11 kb，单 AAV 不够，双 AAV 也往往很吃力，这时候就需要 Triple AAV 出场了。它的核心思路并不是简单“多加一个载体”，而是把同一套表达信息拆成 3 段，分别装进 3 个 AAV，再让它们在同一个目标细胞里重新拼回完整产物。这个“拼回去”的过程，既可以发生在 DNA/RNA 层面，也可以发生在蛋白层面，所以三 AAV 更准确地说是一种容量扩展框架，而不是某一种固定技术。它真正厉害的地方在于，把过去几乎不可能的“全长大基因递送”拉回到了可验证、可优化的现实范围；当然，代价也很明确：3 个载体必须同时进入同一个细胞，后续组装还要足够高效、足够准确，整体工艺难度也会明显上升。

典型设计是利用两对正交的分裂内含肽，将目的蛋白拆分为三段，由三个 AAV 分别递送：

（1）中间片段两端各融合一对内含肽（IntC₁ + IntN₂）；（2）N 端片段融合 IntN₁；（3）C 端片段融合 IntC₂。三个片段在细胞内共表达后，依次发生两步蛋白反式剪接，最终组装出全长蛋白（图8）[9]。

这一策略已在mdx小鼠模型中得到验证[6]，成功表达了全长427 kDa抗肌萎缩蛋白（dystrophin），并显示出优于micro-dystrophin的功能恢复效果。该研究为超大基因的体内递送提供了可行方案，但其在大型动物模型（如猪、狗、羊等）中的验证仍需进一步研究。

图8 两组正交的内含肽三AAV载体递送策略[9]

策略对比总览

二、经典应用案例分析

案例1：Stargardt遗传性黄斑变性的基因治疗（重叠法）[2]

背景：Stargardt病是最常见的遗传性黄斑变性，由ABCA4基因突变导致。ABCA4基因长达6.8kb，远超AAV病毒载体4.7kb的包装容量，传统方法无法递送完整基因。

策略：McClements 等人采用重叠法双AAV载体策略，将ABCA4基因拆成两段（图9），分别装入两个AAV载体，两段设计207-505bp的DNA重叠区。当两个载体同时进入光感受器细胞核后，通过同源重组自动拼接成完整基因，像”分子拼图”一样恢复全长蛋白表达。

图9 ABCA4重叠双载体系统示意图。腺相关病毒（AAV）转基因元件被拆分为两个独立的转基因（上游和下游）。上游转基因包含启动子及ABCA4编码序列的上游片段，下游转基因携带ABCA4编码序列的下游片段以及WPRE和pA元件。当两个转基因进入同一宿主细胞核后，通过重叠区域进行对齐并重组。

实验操作：

在Abca4基因敲除小鼠视网膜下腔注射双AAV混合物，系统测试6种重叠长度（23-1,173bp）。最优组合为含内含子的207bp重叠载体（InC），剂量1×10¹⁰GC/眼。

实验结果：

Western blot证实全长ABCA4蛋白在光感受器外节正确表达，视网膜毒素水平显著降低（p=0.03）。6个月后，治疗眼眼底自发荧光减弱，脂褐素沉积受控，截短蛋白副产物较少，未见明显安全性信号（图10）。

图10 小鼠眼球切片的ABCA4（绿色）和Hcn1（红色）染色。细胞核用Hoescht染色。(A) 野生型SVEV 129小鼠光感受器外节的Abca4染色。(B) 未注射的Abca4⁻/⁻小鼠中Abca4染色缺失。(C) 注射上游载体的Abca4⁻/⁻小鼠中ABCA4缺失。(D) 注射下游载体的Abca4⁻/⁻小鼠中ABCA4染色缺失。(E) 注射双载体的Abca4⁻/⁻小鼠光感受器外节的ABCA4染色。

案例2：DFNB9 型先天性耳聋的基因治疗（内含肽策略，从实验室到临床）[8]

背景：OTOF基因突变导致DFNB9型听神经病（占先天性遗传性耳聋2-8%），编码的otoferlin蛋白在内毛细胞中调控突触囊泡释放。由于OTOF基因过大（约6kb），超过单个AAV载体包装容量。

策略：Tang 等人采用双AAV载体介导的蛋白反式剪接策略（图11），在S818和S1114位点拆分小鼠otoferlin蛋白，通过蛋白质结构预测筛选出最优拆分位点（S1114），将N端片段与分裂内含肽N段（IntN）、C端片段与分裂内含肽C段（IntC）分别融合，包装至AAV-PHP.eB血清型，经圆窗膜（RWM）注射导入新生Otof⁻/⁻小鼠耳蜗，利用分裂内含肽自催化拼接恢复完整otoferlin蛋白功能，实现听力长期稳定恢复。

图11 双AAV病毒载体的构建。将小鼠耳畸蛋白（otoferlin）在S818或S1114残基位点处分割，随后将otoferlin的N端和C端片段分别与分割型Rma内含肽（split Rma intein）一起包装进AAV-PHP.eB载体，并通过圆窗膜（RWM）给药方式注射到小鼠耳蜗内。所使用的小鼠模型为Otof基因缺陷型小鼠。

实验操作：

构建双AAV系统：将小鼠/人源OTOF cDNA在筛选位点分割，分别构建至AAV-载体（CAG/CMV启动子）并包装PHP.eB血清型病毒，滴度1×10¹³ vg/mL。

单侧注射：向新生Otof⁻/⁻小鼠右耳蜗注入2μl混合病毒（N:C=1:1），成年鼠经后半规管注射。

功能评估：注射后1/2/6个月测ABR阈值，免疫荧光检测蛋白共表达率，膜片钳记录囊泡释放和Ca²⁺电流。

实验结果：

听力恢复：注射耳click-ABR阈值恢复至野生型水平（43dB），持续6个月以上；对侧耳改善至52-56dB，证实单侧注射实现双侧疗效。

转导效率：注射耳约70%内毛细胞共表达蛋白片段，对侧耳约35%，与听力改善程度正相关。

功能修复：快速囊泡释放（ΔCm 7.15fF）和囊泡补充速率（287个/秒/活性区）均恢复至野生型水平，Ca²⁺电流正常。

临床转化：人源OTOF系统在小鼠模型中同样有效，无耳毒性，为DFNB9耳聋治疗提供了高效、安全的策略。

图12 使用内含肽介导的小鼠耳畸蛋白（otoferlin）在P0–P2天注射治疗Otof–/–小鼠的双侧耳聋。A 将Rma-S1114包装进双AAV-PHP.eB后注射到Otof–/–小鼠，记录其click-ABR阈值（野生型组，n = 12；注射耳组，n = 6；对侧耳组，n = 6；Otof–/–组，n = 10；AAV-eGFP组，n = 6）。B 将Rma-S1114包装进双AAV-PHP.eB后注射到Otof–/–小鼠，记录其短纯音ABR阈值（野生型组，n = 12；注射耳组，n = 6；对侧耳组，n = 6；Otof–/–组，n = 10；AAV-eGFP组，n = 6）。C、D 将Rma-S1114包装进双AAV-PHP.eB注射后，分析Otof–/–小鼠（P30）注射耳和对侧耳的免疫荧光结果。蓝色、红色和白色分别表示细胞核、N端otoferlin和C端otoferlin。DAPI是核染色染料，N端和C端耳畸蛋白分别用抗N端和C端耳畸蛋白抗体（ab53233，Abcam；PA552935，Invitrogen）进行免疫染色。AAV-eGFP组指仅注射携带eGFP的AAV载体的Otof−/−小鼠，n = 6。比例尺：100 μm（C、D，左侧），10 μm（C、D，右侧）。数据以均值±标准误表示。ns，无显著性差异；**P < 0.01

案例 3：杜氏肌营养不良症（DMD）的基因治疗（三 AAV 内含肽策略）[6]

背景：杜氏肌营养不良症（DMD） 是由 Dystrophin基因突变引起的遗传性肌肉疾病，该基因编码的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）全长 cDNA 约 11.2 kb，是 AAV 大基因递送领域最具挑战性的靶标之一。现有的”微缩化 Dystrophin（micro-Dys / mini-Dys）”策略通过删减非关键结构域将 CDS 压缩至 3.6~5 kb，但删减带来的功能代偿性损失始终是一个争议。

策略：Tasfaout 等人开发了两对正交分裂内含肽介导的三 AAV 系统。将Dystrophin基因拆分成2-3段，分别装入不同AAV载体中，利用两对正交内含肽依次连接。当多个载体同时转导肌肉细胞后，内含肽通过自催化反应将蛋白片段无缝连接成完整的功能性dystrophin蛋白，如”分子缝合”般恢复全长蛋白表达。首次实现了接近全长 Dystrophin（14 个 Rod 结构域，约 8.9 kb CDS）的体内递送（图13）。

图13 三载体分裂内含肽介导的蛋白反式剪接策略示意图。

实验操作：

实验结果：

• AAV6 系统给药可行性验证（8 周龄 mdx⁴ᶜᵛ，治疗 3 个月）：Western blot 定量显示，双 AAV 递送 midi-Dys 表达约达 WT 的 75%；三 AAV 递送 full-Dys 约达 WT 的 31%；对照 μDys5 仅约 8%（图14）。
• AAVMYO 系统递送转导优势（老年组对比 AAV9）：在 17 月龄 mdx⁴ᶜᵛ 治疗 7 个月的实验中，AAVMYO 可获得约 ~60% dystrophin 阳性肌纤维，而 AAV9-μDys5 仅约 ~5%，约为 12 倍差异。
• 组织学改善（骨骼肌/心肌）：治疗后可见病理负担下降，包括中央核肌纤维比例下降，以及纤维化与炎症浸润减轻；整体肌肉结构更接近正常。
• 功能恢复与保护：骨骼肌力量（如 TA specific force）与心脏应激下左室功能均出现明显改善；在老年小鼠中，治疗 7 个月仍维持显著保护效应，可抵御进行性肌肉萎缩与功能退化。

图14 在 mdx4cv 小鼠体内对 AAV6 分体 intein/Dys 构建体的验证。a）对照组或注射 5×10^10 vg 的 AAV6 N 端和/或 C 端分体 mini-Dys/intein 后的胫前肌（T.A）组织裂解液的 Western blot。b）以 GAPDH 归一化后的蛋白表达量，以及c）通过灰度分析（densitometry）计算剪接产物（上方条带）或未剪接产物（下方条带）的比例（WT n=4；注射肌肉 n=5）。d）采用两种不同的双载体组合处理后的胫前肌横切面：苏木精-伊红染色（H&E，上排；比例尺：50 μm），或用针对肌营养不良蛋白（dystrophin）N 端或 C 端结构域的抗体进行免疫标记（下排；比例尺：50 μm）。e）Western blot 显示采用三 AAV 载体策略处理后的胫前肌中全长肌营养不良蛋白的表达。f）全长肌营养不良蛋白表达量以 GAPDH 归一化，以及g）通过灰度分析定量不同产物的比例（每组 n=4 块肌肉）。h）肌肉横断面冷冻切片：H&E 染色（上排；比例尺：50 μm），或用针对 dystrophin 的 N 端、中部或 C 端片段的抗体进行免疫标记（下排；比例尺：50 μm）。i、j）Western blot 显示 WT、注射生理盐水的 mdx4cv，以及接受系统给药（总剂量 2×10^14 vg/kg）的 mdx4cv 小鼠在胫前肌（i）或心肌（j）中 dystrophin 的蛋白表达情况；处理方式包括单载体、双载体或三载体 AAV。k）胫前肌横切面：H&E 染色（上排；比例尺：50 μm），以及 dystrophin 或 laminin 的免疫荧光染色（下排；比例尺：100 μm）

意义：

相比 micro-Dys 策略，该方法递送的蛋白更接近生理结构，理论上可保留更完整的功能，为 DMD 基因治疗提供了新的思路。

四、技术选择的实践建议

在实际设计大基因递送方案时，以下几点建议可供参考：