肺部AAV注射怎么打？

滴鼻注射

适用组织：呼吸系统（上呼吸道）

1.实验前准备

小鼠、病毒储存液（冰上解冻）、动物麻醉系统（异氟烷蒸发器与麻醉箱/鼻罩或小动物腹腔注射麻醉药物）、恒温加热垫（37°C）、无菌PBS（用于病毒稀释）、移液器、无粉乳胶手套

病毒准备

在生物安全柜内，使用无菌PBS将病毒稀释至所需浓度。保持病毒溶液始终在冰上，避免反复冻融或长时间室温放置。

麻醉

将单只小鼠放入麻醉箱，以2.5%异氟烷、1 L/min氧气流量进行麻醉。

2.病毒滴注

A操作者：用带滤嘴的移液枪头，取40 μL（总剂量一半）病毒载体，准备滴鼻。

B操作者：小鼠进入稳定麻醉状态后取出。用惯用手捏住小鼠颈背皮肤，非惯用手拇指压住下颌口部，惯用手手食指轻压鼻梁，防止小鼠用口呼吸及吸入AAV载体（见下图）。将小鼠身体以约45°角斜靠在惯用手手掌上，确保气道开放。

A操作者：将移液枪头垂直（90°）对准小鼠鼻尖，缓慢滴下一滴AAV载体，待液体被吸入后再滴下一滴，直至40 μL全部滴完。

B操作者：滴完后继续保持该姿势30–60 s，防止小鼠吞咽。

一侧鼻孔滴注一半体积的病毒后换另一鼻孔。

3.动物复苏

滴鼻结束后将小鼠放入带有加热垫的空恢复笼，至少观察10 min，直至完全清醒。

图片来源：https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-9139-6_21

4.常见问题和解决方案

气管内注射

1.实验前准备

小鼠、病毒储存液（冰上解冻）、动物麻醉系统（异氟烷蒸发器与麻醉箱/鼻罩或小动物腹腔注射麻醉药物）、可倾斜的手术台/手术板、医用胶布、手术剪、镊子（钝头、弯头）可调的冷光源（如光纤灯或头灯）、胰岛素注射器（配29G针头）、碘伏、70%乙醇、6-0 可吸收缝线、 5-0 单丝缝线、恒温加热垫（37°C）、无菌PBS（用于病毒稀释）、无粉乳胶手套

病毒准备

在生物安全柜内，使用无菌PBS将病毒稀释至所需浓度。保持病毒溶液始终在冰上，避免反复冻融或长时间室温放置。用胰岛素素注射器吸取40–80 μL AAV稀释液，置于冰上备用。

麻醉

将小鼠置于麻醉箱内，以2.5%异氟烷、1 L/min氧气流量麻醉，直至小鼠完全失去意识。将小鼠从麻醉箱移至手术板，使其仰卧，并在鼻部罩上小鼠麻醉面罩，维持麻醉状态。轻捏小鼠后足检查麻醉深度，若仍有反应，继续加深麻醉。

涂抹金霉素眼膏保持眼部湿润。

用胶带将小鼠前肢向两侧伸展固定于手术板上（如图）。使用电动剃毛器剃除颈部毛发，建立清洁手术区。用碘伏/70%乙醇交替对手术区进行消毒。

2.病毒注射

用弯镊夹住前肢间颈部皮肤，用手术剪在颈部正中纵向做一约5–7 mm的小切口（如图）。用钝头镊进行钝性分离，暴露气管环，用非惯用手持弯镊轻轻固定气管。

惯用手手持注射器，针尖斜面朝上，与气管成约45°角，针头指向尾部，刺入气管数毫米（如图）。缓慢将AAV注入气管，注射完毕后等待5 s，再缓慢退针。

用缝合线缝合切口。

3.动物复苏

移除麻醉面罩，将小鼠放入带有加热垫的饲养笼，直至完全清醒。

图片来源：https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-9139-6_21

4.常见问题和解决方案

气管插管注射

适用组织器官：气管、肺

1.实验前准备

小鼠、病毒储存液（冰上解冻）、动物麻醉系统（异氟烷蒸发器与麻醉箱/鼻罩或小动物腹腔注射麻醉药物）、光源(灯或手术头灯)、气管插管、移液器、金霉素眼膏、手术台或垫板(可倾斜45°-60°)、弯头镊子(暴露声门)、恒温加热垫（37°C）、无菌PBS（用于病毒稀释）、无粉乳胶手套

病毒准备：

在生物安全柜内，使用无菌PBS将病毒稀释至所需滴度。保持病毒溶液始终在冰上，避免反复冻融或长时间室温放置。

麻醉

将小鼠置于麻醉箱内，以2.5%异氟烷、1 L/min氧气流量麻醉，直至小鼠完全失去意识。将小鼠从麻醉箱移至手术板，使其仰卧，并在鼻部罩上小鼠麻醉面罩，维持麻醉状态。轻捏小鼠后足检查麻醉深度，若仍有反应，继续加深麻醉。

涂抹金霉素眼膏保持眼部湿润。

2.气管插管

将麻醉好的小鼠取出，仰卧放置于手术板上，用医用胶带将小鼠前肢向两侧伸展固定于手术板上（如图）。使用牙线或橡胶带将小鼠前齿挂在手术台面上部的横杆上，使头部保持伸展状态，调整手术台的倾斜角度，使小鼠嘴端朝向操作者并呈45°夹角。在小鼠鼻孔上方放置连通气体麻醉系统的软管，维持麻醉状态。

用弯头镊子轻轻打开小鼠口腔，将舌头向前拉出，暴露声门。在强光照明下，可以看到声门开合(随呼吸运动)。在吸气相(声门开放时)，将准备好的气管插管沿小鼠舌头中线缓慢插入声门。

确认插管位置正确: 可观察到随呼吸节律的胸廓起伏，轻轻接触导管开口，可感受到气流，如有条件，可用小镜子放在导管口，观察呼吸时镜面是否有雾气形成。

3.病毒注射

右侧肺远端叶选择性插管与注射

完成气管插管后，将手术板顺时针旋转 +30°（如图 A）。握住导管接头，保持其与鼠体中线平行，按体重对应的深度（如表 ）推进。注意：到达深度时可感到阻力，同时小鼠出现轻度呼吸急促。

用移液器将病毒液注入导管。拔出导管，保持体位 30 秒。

左侧肺远端段选择性插管与注射

完成气管插管后，将塑料板逆时针旋转 -74°（图 B），握住导管接头，轻轻加压，使其进入左主支气管；同时向下方（90°）施加适度压力。按表所示深度推进，可感到阻力，提示已进入左肺下段。若出现呼吸急促，将导管退至 20–25 mm 处重新尝试。

插管成功后，需调整体位以利用重力辅助给药：将塑料板旋转至 -30°（图 B）。用移液器将病毒液注入导管。拔出导管，保持体位 30 秒

注意：左肺仅一叶，可允许更大给药量。

4.动物复苏

将动物置于恒温加热垫上，待其完全清醒（通常 2 分钟内恢复）。

图片来源：https://app.jove.com/v/20233/intrabronchial-delivery-technique-to-administer-an-experimental-agent

C57BL/6小鼠中导管插入深度参考

5.常见问题和解决方案