提高生物工程化 AAV 衣壳跨物种转化的最新进展

前言

腺相关病毒（Adeno-associated virus, 简称 AAV）已成为现代体内（in vivo）基因治疗中最重要的递送载体之一。其广泛的组织嗜性（Tropism）、相对优异的安全特性、物理稳定性以及支持转基因长期表达的能力，使其成为眼科、神经科学、神经肌肉疾病、代谢性疾病以及罕见遗传病等众多治疗领域的首选载体平台。

近期发表在《基因治疗》（Gene Therapy）杂志上的一篇名为《提高生物工程化 AAV 衣壳跨物种适用性的最新进展》（“Recent advancements in improving cross-species applicability of bioengineered AAV capsids”）的综述文章，强调了 AAV 衣壳工程的广阔前景以及跨物种转化的复杂性。作者指出，AAV 因其相对较低的免疫原性、极小的毒性、持久的疗效和广泛的嗜性，被广泛接受为体内基因递送载体。但同时他们也强调，不可预测的跨物种适用性仍然是实现更广泛临床转化的主要障碍。该综述重点讨论了合理设计（Rational design）、定向进化（Directed evolution）以及基于人工智能（AI）的衣壳设计等策略，以期创造出具有更强人类转化性的 AAV 变体。

这一议题与基因治疗的开发高度相关。许多 AAV 衣壳最初是在小鼠中发现或优化的，但小鼠的生物学环境与非人灵长类动物（NHP）、大动物及人类存在显著差异。在小鼠模型中表现出极高活性的衣壳，在人类身上可能会丧失活性、表现出不同的体内生物分布（Biodistribution），或触发意料之外的安全问题。因此，现在的核心问题不再仅仅是“我们能否设计出更强大的衣壳？”，而更是“我们能否设计出一种性能可跨物种转化，并最终支持安全、有效的人类治疗的衣壳？”

为什么跨物种转化是 AAV 开发的核心挑战

基于 AAV 的基因治疗已经取得了里程碑式的临床成就。该综述引用了治疗遗传性视网膜疾病的 Luxturna 和治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的 Zolgensma 的里程碑式批准，这些实例帮助确立了 AAV 作为临床验证的基因递送平台的地位。

然而，AAV 在已批准疗法中的成功并不能消除转化过程中的挑战。每一个新的衣壳、靶标组织、给药剂量、给药途径以及治疗载荷（Payload）都会引入新的开发风险。特别是，由于 AAV 的转导过程依赖于多个生物学步骤，衣壳在不同物种之间的性能可能会发生剧烈变化：

• 结合细胞表面的受体或辅助受体
• 胞吞作用与细胞内运输（Intracellular trafficking）
• 内吞体逃逸（Endosomal escape）
• 进入细胞核
• 衣壳脱壳与基因组释放
• 转基因表达
• 免疫识别与清除
• 组织特异性毒性

上述每一个步骤都会受到物种特异性生物学的影响。该综述指出，物种间的遗传差异会影响蛋白质结构、翻译后修饰、剪接机制、表观遗传调控以及参与 AAV 转导的宿主因子。这些差异影响了 AAV 从细胞结合到基因组释放的整个生命周期。

这就是为什么仅凭小鼠的有效性数据，其预测价值非常有限。敲除小鼠虽然可以重现人类的疾病表型，但这并不能保证 AAV 载体能进入相同的人类细胞类型、使用相同的受体、通过相同的胞内途径进行运输，或表现出相同的安全性特征。

AAV-PHP.B 的教训：仅在小鼠中强效是远远不够的

跨物种不确定性最典型的例子之一是 AAV-PHP.B。这种工程化衣壳在某些小鼠品系中表现出极强的 CNS（中枢神经系统）转导能力，这引发了人们对通过系统给药将 AAV 递送到大脑的极大兴趣。然而，随后的研究表明，其神经嗜性特征高度依赖于小鼠特异性的生物学机制，无法预测性地转化到非人灵长类动物（NHP）中。

该综述特别强调，AAV-PHP.B 是通过在单一小鼠模型中进行定向进化开发出衣壳的典型代表，但它随后在其他物种中表现出局限的嗜性和较差的性能。

这一关键教训告诉我们，一种衣壳在特定的生物学背景下可能非常优秀，但当筛选压力与人类相关的生物学机制不一致时，它就会宣告失败。对于转化型的 AAV 开发，衣壳的发现必须围绕保守机制、临床相关的组织屏障以及合适的验证模型来进行设计。

决定 AAV 跨物种性能的五大屏障

该综述将跨物种转化归纳为几个物种依赖性的屏障：受体使用、细胞内运输、免疫识别、转录调控和毒性。这些因素决定了工程化衣壳是否能在发现物种之外保留其功能。

1. 受体使用（Receptor Usage）

AAV 衣壳通过与细胞表面受体、聚糖（Glycans）和辅助受体相互作用来进入细胞。如果靶受体在物种间是保守的，衣壳就有更大的机会从动物模型转化到人类。如果受体是物种特异性的，载体可能在小鼠中表现良好，但在 NHP 或人类中表现极差。这在 CNS、肌肉、肺和靶向肿瘤的 AAV 项目中尤为重要，因为这些组织的屏障和受体表达模式在不同物种之间存在实质性差异。

2. 细胞内运输（Intracellular Trafficking）

进入细胞后，AAV 必须避免被降解、逃逸内吞体、到达细胞核并释放其基因组。有些细胞内机制是广泛保守的，例如与泛素化相关的降解途径，而另一些机制则可能因细胞类型或物种而异。因此，当突变靶向保守的细胞通路时，改善胞内运输的衣壳突变可能提供实现更广泛跨物种性能的途径。

3. 免疫识别（Immune Recognition）

AAV 载体对免疫系统而言并非隐形的。衣壳可被预存抗体（Pre-existing antibodies）中和、激活补体系统，或引发针对被转导细胞的 T 细胞免疫反应。啮齿动物、NHP 和人类之间的免疫识别模式存在差异，这使得依靠单一模型来预测临床免疫原性变得十分困难。

4. 转录调控（Transcriptional Regulation）

即使衣壳成功到达目标细胞，转基因的表达仍取决于启动子和增强子的活性。在小鼠组织中表现优异的启动子在人类组织中可能无法发挥相同的活性。这意味着跨物种转化无法仅靠衣壳工程来解决，表达框（Expression cassette）的设计同样至关重要。

5. 毒性（Toxicity）

毒性可能是临床上影响最深远的屏障。该综述讨论了肝毒性、背根神经节（DRG）病变、补体激活以及血栓性微血管病（TMA），这些安全担忧在不同物种之间存在差异。

策略一：合理设计（Rational Design）

合理衣壳设计利用现有的 AAV 结构和功能知识进行针对性修饰。科学家可以修饰受体结合区域、引入肽段插入、改变表面暴露的氨基酸、减少降解信号或修饰免疫表位（Epitopes）。

该综述将合理设计描述为一种由知识驱动的策略，依赖于对衣壳结构和生物化学的理解。它可以靶向参与受体结合、细胞运输、胞内降解和免疫识别的区域。

肽段插入用于重新靶向（Retargeting）

一种合理设计策略是在衣壳表面插入可被特定受体识别的肽段。这些肽段可以帮助载体与期望的受体相互作用或穿过生物屏障。例如，综述中讨论了 AAV-ie，它是通过在 AAV-DJ 骨架中插入类细胞穿透肽（CPP-like peptide）而构建的，旨在帮助载体到达内耳细胞群。
这种策略很吸引人，因为它可以直接修饰衣壳与细胞的相互作用。然而，为了实现临床转化，被插入肽段结合的受体或细胞通路在理想情况下应当在物种间高度保守。

减少衣壳降解

另一种合理设计策略是减少衣壳的泛素化。AAV 衣壳表面暴露的酪氨酸残基（Tyrosine residues）可能会被磷酸化，从而导致泛素化和蛋白酶体降解。将这些残基进行突变可以改善胞内运输，并增加到达细胞核的病毒颗粒数量。
该综述指出，酪氨酸突变的 AAV 载体在来源于小鼠和人类的眼部细胞系中均表现出高效的转导，这表明泛素化介导的降解可能代表了一种保守的细胞内屏障。

减少免疫识别

衣壳工程也可用于减少免疫识别。例如，可以修饰抗体结合区域以避免中和。然而，免疫逃逸非常困难，因为抗体表位和补体识别模式在人类和动物模型之间可能存在差异。旨在逃避人类血清中和的衣壳在啮齿动物或 NHP 中可能不会表现出相同的行为，这增加了临床前测试的复杂性。

合理设计的优势与局限性

在已知生物学机制的情况下，合理设计非常强大。它相对可预测、由机制驱动，且非常适合解决特定问题。然而，它的探索空间受限于人类已掌握的知识。如果关键受体、运输途径或免疫决定因素尚不明确，合理设计可能无法找到最佳解决方案。
因此，合理设计往往在与更广泛的筛选方法（如定向进化和 AI 辅助预测）结合时最为有效。

策略二：定向进化（Directed Evolution）

定向进化采用了更具经验主义（Empirical）的方法。研究人员不进行单一或少数特定突变的设计，而是创建庞大的衣壳文库，并施加筛选压力以鉴定出具有所需特性的变体。

该综述将定向进化描述为一种生成大型 AAV 变体文库的方法，在靶标组织或细胞系上进行多轮筛选，然后对富集的候选变体进行测序和扩增。最终的候选变体通常会在 NHP 等模型中做进一步评估，以评估其转化潜力。

Cre 依赖型定向进化

Cre 依赖系统利用细胞类型特异性的 Cre 重组酶表达，来筛选在体内转导特定细胞群的载体。例如，M-CREATE 平台利用表达 Cre 的靶细胞，选择性地扩增进入期望细胞类型的 AAV 变体。这种方法可以提高筛选过程中的细胞类型特异性。
然而，许多 Cre 依赖的筛选是在小鼠中进行的，这带来了转化风险。如果筛选出的衣壳依赖于小鼠特异性的受体或组织环境，它在人类中的表现可能大相径庭。AAV-PHP.B 是一个重要的警示案例，它在小鼠中的超强 CNS 活性与无法转化到灵长类动物的特殊生物学机制绑定。

非 Cre 依赖型定向进化

非 Cre 依赖的方法可以通过在更具转化相关性的组织或物种中进行筛选，来减少上述部分局限性。该综述介绍了通过 NHP 大脑筛选鉴定出的 AAV.Ep，它在小鼠大脑、NHP 大脑以及人 iPSC 源性皮层神经元中均表现出提升的转导活性。同时还介绍了用于视网膜光感受器转导筛选出的 AAV2.GL 和 AAV2.NN，它们在小鼠、狗和 NHP 中均表现出活性。
这些例子表明，直接在大动物或与人类相关的系统中进行筛选，可以提高衣壳在小鼠模型之外保持活性的信心。

DELIVER 与肌肉嗜性 AAV 工程化

DELIVER 平台是另一个重要范例。它利用组织特异性启动子驱动的筛选，来鉴定在各种动物模型的靶组织中具有功能活性的 AAV 变体。在该系统中，衣壳文库的表达受肌肉特异性启动子控制，从而使研究人员能够富集那些成功转导肌肉细胞的变体。
该综述重点介绍了在食蟹猴肌肉组织中筛选鉴定出的变体 MyoAAV4a。MyoAAV4a 在食蟹猴和人类中均表现出增强的肌肉转导活性。从机制上讲，其引入的 RGD 肽段插入与整合素（Integrin）相关的肌肉靶向有关，且整合素在小鼠、NHP 和人类肌肉中均有表达。
这是一个重要的转化原则：当衣壳靶向在物种间保守的受体或通路时，它更有可能实现跨物种转化。

CNS 与血脑屏障靶向

该综述还讨论了 TRACER 平台（概念上类似于 DELIVER）。通过 TRACER 鉴定出的 AAV 变体 VCAP-102 被证实可以与保守的脑血管受体 ALP 相互作用，从而增强跨越血脑屏障的能力。
对于 CNS 基因治疗，这种靶向保守受体的方法尤为重要。血脑屏障是主要的递送障碍，血管生物学中的物种差异会使“从小鼠到人类”的转化变得异常困难。

定向进化的优势与局限性

定向进化可以发现那些很难通过合理设计得到的衣壳。它不需要对受体生物学有完全的先验知识，并能在功能选择压力下筛选巨大的序列空间。
然而，它也有局限性。筛选产物可能具有随机性，且性能提升背后的机制可能仍不明确。综述指出，虽然像 AAV.CAP-B10 或 AAV2.GL 这样的变体表现出了优异性能，但往往缺乏机制上的合理解释。文章建议将受体发现、膜蛋白质组学、受体敲除或过表达验证以及结构生物学整合起来，构建一个“筛选—靶点发现—机制验证”的闭环。

策略三：AI 辅助衣壳设计（AI-Assisted Capsid Design）

AI 辅助设计正成为 AAV 工程中越来越重要的工具。机器学习模型可以分析序列与功能之间的关系，并预测具有所需特性的衣壳变体。这有助于减轻动物筛选的负担，并加速候选变体的优先级排序。

该综述指出，AI 设计利用训练数据来识别模式，并对新的、未见过的序列进行预测。

AAV.Anc80L65 与祖先序列重建（Ancestral Reconstruction）

与 AI 相关的衣壳设计最著名的例子之一是 AAV.Anc80L65，它是通过最大似然祖先序列重建技术（Maximum likelihood ancestral sequence reconstruction）开发出来的。该方法通过计算，从野生型 AAV 数据中重建了祖先 AAV 的序列。
根据该综述，与野生型 AAV 相比，AAV.Anc80L65 在小鼠和灵长类动物中均展示出更优异的肝脏转导活性，随后的研究还将其应用扩展到了 NHP 耳蜗。

AI 用于多参数优化

AI 方法最终可帮助同时优化衣壳的多种属性，包括组织嗜性、可生产性（Manufacturability）、免疫逃逸、跨物种适用性和安全性。该综述重点介绍了 Fit4function 模型，该模型将衣壳氨基酸序列特征与肝脏靶向和跨物种适用性等功能特征联系起来。然而，作者也指出，合并 NHP 转导数据可以进一步提高预测精度。

数据质量是核心限制

AI 模型的可靠性完全取决于其训练数据集。如果模型主要在小鼠或体外数据上进行训练，它可能无法准确预测人类的性能。来自 NHP、人类原代细胞、类器官和多组学研究的高质量数据集，对于提高 AI 驱动的衣壳预测至关重要。
综述强调，基于 AI 的设计可以降低大规模动物筛选的成本，但它需要强大的训练数据集，且计算机生成的衣壳仍必须经过全面的体内验证。

安全性与毒性：设计更宽的治疗窗口

AAV 衣壳工程不仅是为了提高效力，也是为了拓宽治疗窗口（Therapeutic window）。一个更优异的衣壳在理想情况下应当向靶组织递送更多载体、减少非靶向暴露、降低所需剂量，并减轻免疫或毒性负担。

综述将毒性描述为临床上影响最深远的跨物种屏障。肝毒性、DRG 病变、补体激活和血栓性微血管病在不同物种之间可能存在差异，且无法通过小鼠研究进行可靠预测。

通过更好的靶向降低给药剂量

改善衣壳设计最实际的安全益处之一是降低给药剂量。如果工程化衣壳能够更高效地将载荷递送到目标组织，则可以降低总给药剂量。这可以减少肝脏蓄积并减轻全身性免疫负担。
综述引用了 MyoAAV4a 作为例子，指出它在 NHP 中实现治疗性肌肉转导所需的剂量比 AAV9 低 10 倍，从而潜在降低了肝脏蓄积和相关的肝毒性。文章还强调了 AAV.CAP-B10，它在普通猕猴（Marmosets）中显示出降低的肝脏靶向性。

物种特异性毒性需要大动物测试

有些毒性无法单靠降低剂量来解决，因为它们可能涉及物种特异性的分子相互作用。该综述指出，高剂量 AAV 给药后的 DRG 病变已在猪和 NHP 中被证实，但在小鼠中未见报道。对于此类屏障，在多种大动物模型中进行经验性测试依然必不可少。

ITR 工程化作为正交安全策略

尽管衣壳工程对嗜性和递送至关重要，但其他载体设计元素也会影响安全性。该综述讨论了 ITR（反向末端重复序列）工程化作为一种正交策略，指出重塑 ITR 区域以消除 p53 结合位点可能会减少 AAV 诱导的人类胚胎干细胞凋亡。
这突出了一个重要观点：更安全的 AAV 治疗可能需要对整个载体系统（而非仅仅是衣壳）进行整体优化。

AAV 衣壳工程三大主流方法对比

仅靠衣壳工程还远远不够

AAV 衣壳工程可以改善受体结合、生物分布、细胞内运输和免疫特性。然而，它并不能完全解决每一个转化挑战。

该综述指出，转录调控是一个关键的缺口，因为衣壳工程本身并不能决定启动子或增强子的活性。需要细胞特异性启动子和调控元件，来驱动在预期细胞类型中的表达，同时限制非靶向表达。

例如，靶向肌肉的衣壳可以改善向骨骼肌或心肌的递送，但启动子的选择依然决定了转基因表达是否仅局限于期望的细胞。同样，靶向 CNS 的衣壳可以跨越血脑屏障，但启动子的选择会影响表达是发生在神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞还是其他细胞群中。

这意味着转化型的 AAV 设计应当综合：

1. 衣壳选择或衣壳工程
2. 组织或细胞特异性启动子设计
3. 载荷优化
4. 剂量选择
5. 给药途径
6. 生产质量控制（Quality control）
7. 生物分布分析
8. 免疫原性评估
9. 大动物及人类相关模型的验证

构建更具预测性的 AAV 开发工作流程

该综述认为，早期的 AAV 研究过于依赖小鼠，导致其在人类中的疗效难以预测。为了改善转化，目前的解决方案正越来越多地依赖大动物模型（尤其是 NHP），以及人类来源的系统（如培养的细胞和类器官）。

一个更具预测性的 AAV 开发工作流程应当包含以下几个层面：

1. 从人类相关的生物学机制出发

开发者不应只问哪种衣壳在小鼠模型中表现最好，而应当问哪些受体、运输机制和细胞内通路在模型动物和人类之间是保守的。综述建议鉴定出 AAV 变体与之结合的受体及胞内相互作用配体，然后优先选择那些靶向在序列、结构和组织特异性表达上高度保守的蛋白质的衣壳。

2. 尽可能使用多物种筛选

当跨多个物种或在人类相关的系统中施加筛选压力时，定向进化的预测性会更强。这种方法减少了筛选出依赖于单一物种特异性受体的变体的概率。

3. 整合人类细胞和类器官

人类原代细胞、iPSC 源性细胞、类器官以及体外组织模型可以提供宝贵的转化见解。这些模型虽然不能完全取代动物实验，但有助于在进行昂贵的体内研究之前，鉴定出能与人类生物学机制发生相互作用的衣壳。

4. 将 AI 作为预测工具，而非替代验证的手段

AI 可以帮助对候选衣壳进行优先级排序，但预测出的变体仍需要生物学验证。最强大的 AI 工作流将结合序列数据、功能筛选、多组学、NHP 数据和人类细胞数据。

5. 跨相关模型验证安全性

毒性在物种之间往往不是线性关系的。该综述警告称，不要认为跨物种研究遵循一条从“小鼠 $\to$ 猪 $\to$ NHP $\to$ 人类”的简单线性路径。进化生物学并不总是遵循线性模式，通过多种动物模型筛选出的变体仍有可能在人类临床试验中宣告失败。

对 AAV 研究人员的实际启示

对于从事 AAV 研究的学术和转化科学工作者来说，核心信息非常明确：衣壳的选择应当由具体的生物学问题、靶组织、模型系统和转化目标来引导。

对于早期的探索性研究，标准血清型可能已经足够。但对于疗法开发（尤其是系统给药递送），研究人员必须考虑该衣壳的作用机制是否与人类相关。

关键考量问题包括：

• 该衣壳使用的是什么受体或通路？
• 该受体在小鼠、NHP 和人类组织中是否保守？
• 靶细胞类型在人类组织中是否表达该受体？
• 该衣壳是否会增加非靶向的肝脏暴露？
• 该衣壳是否允许降低给药剂量？
• 该衣壳是否在人源细胞或类器官中进行过测试？
• 它是否在大动物或 NHP 中进行过评估？
• 启动子在不同物种之间的行为是否相似？
• 预期有哪些免疫或毒性风险？
• 该载体能否在所需的规模下实现稳定一致的生产？

这些问题有助于推动 AAV 的开发跨越简单的“效力排名”，走向具有临床意义的载体选择。

派真生物（PackGene）如何支持 AAV 研发

随着 AAV 项目变得越来越复杂，研究人员在载体设计、生产、衣壳选择、分析检测和转化规划方面需要一体化的支持。派真生物通过可定制的 AAV 生产和载体开发解决方案来支持 AAV 研究，旨在帮助研究人员评估衣壳性能、构建体设计以及特定应用场景的递送需求。

对于早期的学术研究，这可能涉及选择合适的血清型、优化载体基因组设计，以及生产用于体外或体内研究的 RUO（科研级）级 AAV。对于更先进的转化项目，额外的考量可能包括可放大生产、杂质控制、空/满衣壳分析、基因组完整性评估、活性测定（Potency assay）开发以及可比性研究规划。

AAV 开发的未来将需要发现生物学与可生产性（Manufacturability）之间更紧密的协调。一种衣壳不仅必须在生物学上表现优异，还必须是可生产、可纯化、可表征的，并适用于下游开发。

结论

AAV 衣壳工程正在迅速发展，但跨物种转化仍是该领域最重要的挑战之一。在小鼠中表现出色的衣壳在 NHP 或人类中可能无法保持相同的性能。这是因为 AAV 的递送取决于许多对物种敏感的变量，包括受体使用、细胞内运输、免疫识别、转录调控和毒性。

合理设计提供了机制上的精准性；定向进化提供了探索的威力；AI 辅助设计提供了预测能力和规模。然而，单一策略都无法孤立成功。未来最强大的方法必然是将机制导向的工程设计、多物种筛选、人类相关模型、多组学、NHP 验证以及严格的安全性评估相结合。

对于下一代 AAV 疗法，成功不仅取决于找到更强效的衣壳，还取决于开发出更具可预测性、更安全、可生产且具有临床相关性的载体。因此，跨物种适用性不仅是一个科学挑战，更是将 AAV 创新转化为真实临床疗效的核心要求。

参考文献

Recent advancements in improving cross-species applicability of bioengineered AAV capsids. Haolai et al., Gene Ther. 2026 Jun 27.