AAV（Adeno-Associated Virus，腺相关病毒）载体设计直接关系到后续病毒包装和基因表达效果。实际项目中，AAV载体出现问题并不一定是某个序列设计错误，更多时候是载体容量、表达元件、GOI（Gene of Interest，目的基因）以及实验需求之间没有做好匹配。
以下是AAV载体设计过程中比较常见的问题。
1. 忽略AAV载体的包装容量
AAV的基因组包装容量有限。常规重组AAV（rAAV）载体中，两个ITR之间的基因组长度通常以约4.7 kb为重要参考范围。当载体长度接近或超过这一范围时，可能影响包装效率，并增加基因组不完整或异常包装的风险。
计算载体长度时，不能只看GOI的长度。两个ITR之间的所有序列都需要计算在内，包括启动子、增强子、GOI、WPRE、poly(A)以及其他调控元件。
因此，设计AAV载体时应先计算完整表达盒的长度，再确定是否需要精简启动子、删除非必要调控元件，或者调整整体载体设计。
2. ITR序列存在问题
ITR（Inverted Terminal Repeat，末端反向重复序列）是AAV载体的重要顺式元件，在AAV基因组复制和包装过程中发挥重要作用。
ITR具有特殊的二级结构，在质粒构建和扩增过程中相对容易出现不稳定情况。常见问题包括ITR突变、缺失或重排。
因此，AAV质粒不能只确认GOI是否正确。对于ITR相关区域，也需要根据载体情况采用合适的方法进行质量确认。
3. 启动子选择不合适
启动子决定GOI的转录表达特征，是AAV载体设计中需要重点考虑的部分。
有些项目直接使用强组成型启动子来获得较高表达，但强启动子并不一定适合所有实验。如果研究目标是某个特定组织或细胞类型，启动子缺乏特异性可能导致非目标组织产生表达。
启动子的选择通常需要结合目标组织、目标细胞、动物种属、给药方式以及预期表达水平进行判断。
如果需要组织或细胞类型特异性表达，应优先考虑具有相应特异性的启动子或调控元件。
4. 只计算GOI长度，没有计算完整载体长度
这是AAV载体设计中很容易被忽略的一点。
例如，一个常见表达框架可能包含：Promoter + GOI + WPRE + poly(A)
即使GOI本身没有超过AAV的常规包装范围，加上启动子、WPRE和poly(A)等元件后，整个载体仍然可能过长。
因此，AAV载体设计不能只看GOI有多少kb，而应以两个ITR之间的完整序列长度作为评估依据。
对于较大的GOI，可以根据实际需求考虑使用更小的启动子、去除非必要元件，或者采用其他载体设计方案。
5. GOI序列本身没有充分评估
GOI能够正确插入载体，并不代表其一定适合AAV表达。
设计时可以关注GOI的长度、GC含量、重复序列以及其他可能影响质粒稳定性或表达的序列特征。对于部分基因，还需要考虑密码子优化、潜在异常剪接等问题。
不过，密码子优化并不是所有AAV项目都必须进行。是否需要优化，应根据目标物种、GOI序列特征和实际表达需求判断。
6. 多基因表达设计过于复杂
如果一个AAV载体需要同时表达两个或多个基因，载体设计会更加复杂。
常见设计方式包括双启动子、IRES和2A肽等。不同方案对载体长度、蛋白表达水平以及不同基因之间的表达关系都有影响。
例如，双启动子可以分别控制不同基因，但会增加载体长度；2A肽可以在一个表达框架中表达多个蛋白，但不同蛋白的表达并不完全等同于两个独立表达盒。
因此，多基因AAV载体设计时，需要在表达需求和载体容量之间进行取舍。
7. 没有同时考虑AAV衣壳和启动子
AAV体内表达效果并不是单纯由血清型决定的。
AAV衣壳会影响病毒进入细胞及组织分布等过程，而启动子主要影响进入细胞后的基因表达。动物种属、给药途径和剂量同样会影响最终结果。
因此，选择AAV载体时，不能简单按照“某个血清型在文献中效果好”直接套用。
实际设计通常需要结合：
动物种属 + 给药途径 + 目标组织 + 目标细胞 + AAV衣壳 + 启动子
同一种衣壳在不同动物种属或不同给药方式下，表现可能存在明显差异。
8. RNA表达载体设计不合理
如果AAV用于shRNA、miRNA等RNA表达，除了靶序列本身，还需要考虑RNA的表达和加工方式。
例如，shRNA或miRNA载体需要综合考虑靶序列、启动子、RNA加工以及潜在脱靶效应。
因此，不能简单地将一段目标基因序列放入AAV载体，就认为一定能够获得理想的基因敲低效果。
9. CRISPR载体没有提前考虑容量
AAV用于CRISPR基因编辑时，载体容量通常是设计阶段需要重点考虑的问题。
如果希望在一个AAV载体中同时携带Cas蛋白表达框架和sgRNA表达元件，Cas蛋白本身可能已经占据较大的载荷空间，再加上启动子、poly(A)等元件后，很容易接近AAV的包装容量范围。
因此，设计CRISPR相关AAV载体时，应在项目初期就计算载体总长度。对于较大的编辑系统，可以根据具体方案考虑双AAV等策略，而不是等载体构建完成后再判断是否能够包装。
10. 对照载体没有提前规划
AAV实验中的对照也应该在载体设计阶段确定。
例如，基因过表达实验可以根据研究目的设置相应的阴性对照或空载体对照；基因敲低实验可以设置非靶向shRNA对照；CRISPR实验则通常需要相应的非靶向sgRNA对照。
具体使用哪一种对照，需要根据实验目的和研究体系确定，并不存在适用于所有AAV实验的统一对照载体。
11. 包装前没有充分确认质粒序列
AAV包装前，质粒序列确认是非常重要的一步。
除了确认GOI序列，还应检查启动子、表达框架、连接区域以及其他关键元件是否与设计一致。对于ITR，也应关注其完整性和结构是否正常。
如果质粒本身存在序列错误，即使后续能够获得较高的AAV滴度，也不能解决载体设计或序列本身的问题。
因此，在进入AAV包装之前，应根据载体结构选择合适的鉴定和测序方法，对关键区域进行确认。
AAV载体设计时建议重点检查什么？
一个AAV载体设计完成后，可以按照以下几个方面进行检查：
载体长度： 两个ITR之间的总长度是否处于合理范围。
ITR： ITR序列是否正确、完整，质粒扩增后是否存在异常。
表达框架： Promoter、GOI、WPRE、poly(A)等元件的位置、方向是否正确。
GOI： 序列、阅读框和长度是否符合设计要求，是否存在影响稳定性或表达的特殊序列。
组织特异性： 启动子和AAV衣壳是否与目标组织、目标细胞及动物模型相匹配。
多基因或基因编辑： 是否提前考虑载体容量，以及表达策略是否合理。
实验对照： 是否根据具体研究目的设置相应的阴性或阳性对照。
质粒质量： AAV包装前是否完成必要的质粒鉴定和测序。
总结
AAV载体设计中比较常见的问题，主要集中在载体长度、ITR稳定性、启动子选择、GOI设计、多基因表达以及衣壳与实验模型的匹配等方面。
其中，载体总长度和ITR完整性是设计阶段尤其需要关注的内容。对于需要进行动物实验的项目，还应结合动物种属、给药途径、目标组织和目标细胞选择合适的衣壳与表达调控元件。
一个合理的AAV载体设计，应在有限的载体容量内完成必要的表达功能，同时尽量避免加入不必要的序列。载体设计完成后，再通过质粒鉴定和测序确认设计是否真正落实到最终质粒中，可以减少后续AAV包装和实验过程中不必要的问题。
关于派真
作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。
凭借我们独立知识产权的π-alphaTM 293 细胞AAV高产技术平台，我们能将AAV产量提高多至10倍，每批次产量可达1×10¹⁷vg，以满足多样化的商业化和临床项目需求。此外，我们定制化的mRNA和脂质纳米颗粒（LNP）产品及服务覆盖药物和疫苗开发的各个阶段，从研发到符合GMP的生产，提供端到端的一站式解决方案。
