派真生物在 bioRxiv 发表最新成果：多维度精准降低 DNA 杂质，助力超高纯度 rAAV 生产

作为基因治疗 CRO& CDMO 与递送技术领域的持续创新者，派真生物（PackGene）近日在重组腺相关病毒（rAAV）载体生产工艺开发方面取得重要进展。由派真生物研发团队完成的最新研究 “Precision DNA Impurity Reduction Approaches for Ultra-Pure rAAV Manufacturing” 已发表于预印本平台 bioRxiv。

该研究系统解析了 rAAV 生产过程中被衣壳“误包装”的 DNA 杂质来源，并围绕质粒骨架 DNA 与宿主细胞基因组 DNA（host cell DNA, hcDNA）两大关键杂质，建立了一系列可在上游生产环节实施的精准降低策略，为临床级 rAAV 载体的高纯度、可放大、符合 cGMP 要求的生产提供了新的工艺思路。

原文链接  https://doi.org/10.64898/2026.04.07.716878

rAAV 生产中的“隐形乘客”：DNA 杂质为何值得关注？

rAAV是当前基因治疗中最重要的递送载体之一，已被广泛应用于遗传性眼病、神经肌肉疾病、血友病等多类疾病的治疗探索。然而，随着越来越多 rAAV 药物进入临床开发和商业化阶段，行业对载体质量的要求也不断提高。

在 rAAV 生产过程中，理想状态下，病毒衣壳中应包装的是设计好的治疗性基因表达盒，也就是 ITR-to-ITR 区域。但在实际生产中，AAV 衣壳并非总能做到“只装该装的货物”。一些来自生产质粒骨架、Rep/Cap 区域、Helper 质粒，甚至宿主细胞基因组的 DNA 片段，也可能被错误包装进病毒颗粒中。

这些 DNA 杂质就像混入“快递包裹”中的隐形乘客，虽然比例可能不高，却可能带来潜在风险：

• 外源 DNA 进入体内后可能诱发免疫反应；
• 污染序列若具有表达潜力，可能导致非预期生物学效应；
• 载体基因组组成不均一，会影响批次一致性和疗效稳定性；

在监管层面，残留 DNA 与包装杂质是临床级 AAV CMC 审评中的关键质量属性。

因此，如何从源头减少 rAAV 生产中的 DNA 杂质，已经成为推动 AAV 基因治疗走向更安全、更可控、更高质量生产的重要课题。

精准溯源：rAAV 中的 DNA 杂质主要来自哪里？

在本研究中，派真生物研究团队首先利用下一代测序（NGS）和 qPCR方法，对纯化后的 rAAV 颗粒中被包装的 DNA 序列进行了系统分析。

结果显示，在常规 rAAV-eGFP 制备中，大部分测序 reads 如预期定位于目标 ITR-to-ITR 区域，占比达到 98%以上。但同时也检测到一定比例的非目标 DNA 序列，占比比较高的包括质粒骨架 DNA、RepCap 相关序列、Helper 相关序列和宿主细胞基因组 DNA。

更值得注意的是，在空壳相关样品中，非目标 DNA 的比例显著升高，其中 pRepCap 相关序列和质粒骨架序列占比较高。这提示，AAV 的误包装并不是随机事件，而可能与 ITR、P5 启动子及 Rep 蛋白识别相关结构有关。

简单来说，AAV 的包装系统有时会把一些“长得像目标货物”的 DNA 片段误认为可包装基因组，从而装进衣壳中。

这一发现为后续工艺优化指明了方向：如果能够在生产过程中精准切断或分离这些容易被误包装的 DNA 区域，就有机会显著降低杂质水平。

四大策略同台比较：从源头降低质粒骨架 DNA

TelN/TelROL：有效降低骨架残留，但需平衡产量

研究团队在 GOI 质粒的 ITR 两侧引入 TelROL 位点，并通过 TelN 酶进行处理，使目标表达盒与质粒骨架发生分离。

结果显示，TelN/TelROL 策略能够显著降低 ori/WPRE 比值，即质粒骨架相对于目标载体基因组的比例。在部分条件下，ori/WPRE 可降低至对照的约 20%–30%。

不过，当 TelROL 位点被进一步引入 pRepCap 质粒时，虽然杂质进一步降低，但载体基因组滴度也受到明显影响。这提示，Rep/Cap 表达区域对质粒结构较为敏感，过度干预可能影响 AAV 产量。

I-SceI：稳定降低污染，但效果相对温和

I-SceI 是一种识别特定长序列的巨核酸酶。研究团队将 I-SceI 位点插入 GOI 质粒 ITR 两侧，并通过体外消化、瞬时表达或构建稳定表达细胞系等方式进行测试。

结果表明，I-SceI 可将 ori/WPRE 比值降低至对照的约 23%–41%，说明其能够稳定减少质粒骨架 DNA 污染。但整体来看，其降低幅度不如后续的 Cre/LoxP 系统显著。

CRISPR/Cas9：降低效果明显，但工艺适配仍需优化

CRISPR/Cas9 作为精准切割工具，也被用于去除或破坏易误包装的质粒骨架区域。研究发现，在瞬时加入Cas9 或将 Cas9 表达盒整合至 Helper 质粒时，ori/WPRE 可降低至对照的约 10%–16%。

然而，使用稳定表达 Cas9的细胞系时，改善效果相对有限。研究团队认为，这可能与 Cas9 表达时机、剂量、切割效率以及潜在脱靶风险有关。因此，CRISPR/Cas9虽然具备较强的 DNA 降低能力，但作为临床级 rAAV 生产中的独立方案，仍需要更谨慎的工艺评估。

核心突破：Cre/LoxP 几乎清除可检测质粒骨架 DNA

在所有测试策略中，Cre/LoxP系统表现最为突出。

研究团队在 GOI 质粒的 ITR 两侧布置 loxP 位点，并通过Cre重组酶将原始质粒重组成两个环状小分子：一个携带目标 AAV 基因组，另一个携带质粒骨架。由于目标表达盒与骨架被物理分离，骨架序列被误包装的概率显著下降。

实验结果显示：体内表达 Cre 后，ori/WPRE 最低可降至对照的 约3%；使用不同强度启动子驱动Cre，均可稳定降低质粒骨架污染；将 Cre表达盒整合至 Helper 质粒后，不仅降低杂质，还可在部分条件下提高 WPRE 滴度；

NGS 结果显示，质粒骨架 reads 从对照组的 0.186% 降至 0.006% 和 0.004%，接近完全清除(Table 2)。

这意味着，Cre/LoxP 不仅能够显著提升 rAAV 的 DNA 纯度，而且具备较好的工艺兼容性。其可通过 Helper 质粒编码 Cre，或通过构建Cre 稳定表达生产细胞系实现，便于整合进现有 HEK293 瞬时转染生产流程。

可以说，Cre/LoxP 策略为 rAAV 生产提供了一种“边生产、边净化”的上游工艺路径。

不止质粒 DNA：caspase 抑制剂显著降低宿主细胞 DNA

除了质粒来源 DNA，宿主细胞基因组 DNA 也是 rAAV 生产中的另一类重要杂质。研究团队推测，生产过程中细胞凋亡导致基因组 DNA 片段化，可能会增加 hcDNA 被非特异性包装进 AAV 衣壳的机会。

基于这一思路，团队筛选了多种凋亡相关抑制剂，重点评估了 caspase 抑制剂 Emricasan 和 Q-VD-OPh 对 hcDNA 水平的影响。

结果显示，在不显著影响 rAAV 基因组滴度的前提下，添加Emricasan 或 Q-VD-OPh 可将 hcDNA 降至对照的 0.01–0.03 倍（图1）。换句话说，适当抑制生产阶段的细胞凋亡，可显著减少宿主基因组 DNA 片段进入病毒颗粒的机会。这为 rAAV 生产中 hcDNA 控制提供了一个简洁有效的新方向。

图1 添加Caspase抑制剂以降低rAAV颗粒中的宿主细胞DNA（hcDNA）残留

从工艺优化到临床转化：高纯度 rAAV 的现实意义

本研究不仅是一项基础工艺探索，更具有明确的产业化价值。

对于基因治疗药物开发而言，rAAV 的质量控制贯穿从早期研究到 IND 申报、临床试验和商业化生产的全过程。其中，DNA 杂质控制直接关系到产品安全性，批次一致性，载体有效载荷纯度，临床剂量窗口，CMC 申报质量和大规模生产可控性。

派真生物此次提出的策略，尤其是 Cre/LoxP 介导的生产过程内 minicircle 形成方案，具有以下优势：

1）不依赖额外复杂 DNA 原料制备流程；

2）可整合至现有三质粒或改良三质粒系统；

3）在降低质粒骨架污染的同时可保持甚至提高载体滴度；

4）与 caspase 抑制剂等 hcDNA 控制策略具备组合应用潜力；

有望满足临床级 rAAV 对更高纯度和更低杂质的监管要求。

平台化工艺工具箱，赋能更安全的 AAV 基因治疗

从衣壳工程到生产工艺优化，AAV 技术的进步不仅依赖“递送到哪里”，也依赖“生产得多纯”。如果说新型衣壳决定了 AAV 能否精准到达目标组织，那么高纯度生产工艺则决定了这一递送工具能否安全、稳定、可规模化地走向临床。

本研究通过系统比较多种 DNA 杂质降低策略，最终识别出Cre/LoxP介导的 minicircle 形成是降低质粒骨架污染的优选方案；同时，caspase 抑制剂补充为降低 hcDNA 提供了有效补充路径。二者共同构成了一个面向临床级 rAAV 生产的高纯度工艺工具箱。

未来，随着这些策略在不同 AAV 血清型、不同生产体系以及更大规模工艺中的进一步验证，将有望为基因治疗药物开发提供更可靠的质量保障。

关于派真生物

广州派真生物技术有限公司（PackGene）是一家专注于基因递送技术研发和服务的创新型生物技术公司，在广州和美国休斯顿设有研发/生产中心。公司致力于开发新一代基因递送载体，为全球基因治疗和基础科研提供创新解决方案。

派真生物拥有完整的 AAV 载体研发与生产技术平台，可提供从载体设计、衣壳工程、质粒构建、病毒包装到工艺开发的一站式服务，产品已服务于全球众多科研机构和生物医药企业。

本研究相关专利：WO2025118911A1。

参考资料：

Precision DNA Impurity Reduction Approaches for Ultra-Pure rAAV Manufacturing. bioRxiv 2026.04.07.716878; doi: https://doi.org/10.64898/2026.04.07.716878