小鼠尾静脉注射 AAV 的剂量计算、配液与操作流程

适用范围：尾静脉注射适用于 AAV 等病毒载体的全身循环给药，常用于肝脏、心肌、骨骼肌及部分血管相关研究；具体转导效率取决于 AAV 血清型、启动子、剂量、动物年龄和品系等因素。

1.病毒的注射剂量与体积的计算（以AAV为例）

a.称体重。把当天要注射的所有小鼠逐一称重，算出一个“平均体重”备用。

b.查上限——每只小鼠最多能打多少液体。按动物中心规定，常用上限为 10 µL/g（机构不同上限可能也不同）。

最大注射体积（µL）= 10 µL/g × 平均体重（g）,举例：平均体重 20 g → 最多 200 µL/只。

c.定剂量——按“固定总量”还是“按体重”

方案 A：固定总量（简单直观），所有小鼠统一给 1.5 × 10¹² vg，不管体重差异。

方案 B：按体重计算（更严谨，尤其雌雄混用时推荐）。注射当天再称一次每只小鼠实际体重。例：设定剂量为 5 × 10¹³ vg/kg，小鼠体重 20 g（0.02 kg），则病毒注射量(vg) = 5 × 10¹³ vg/kg * 0.02kg = 1 × 10¹² vg。

注意：在某些临床前研究中，使用 vg/kg 作为剂量单位比 vg/只小鼠更为合适，这样可以确保注射剂量之间具有可比性。这是因为同年龄段的雄性和雌性小鼠之间存在体重差异，或者即使是同一性别的小鼠之间也可能存在体重差异。

d.配液——把AAV原液稀释到可注射体积

注射用病毒液（工作液）的浓度（vg/µL）= 每只小鼠的病毒注射总量（vg）/注射体积（µL）；

用于注射的病毒载体总量（vg）= 病毒工作液浓度（vg/µL）x 需要准备的工作液总体积（µL）；

需要准备的AAV 原液体积（µL）= 用于注射的病毒载体总量（vg）/ AAV原液滴度（vg/mL）x 1000（µL/mL）；

配制病毒工作液需要加入的无菌PBS体积（µL） = 需要准备的工作液总体积（µL）- 需要准备的AAV 原液体积（µL）；

举例：注射剂量6 × 10¹³ vg/kg，注射体积200µL，小鼠体重25g（0.025kg），AAV原液滴度3 × 10¹³ vg/mL ；

每只小鼠的病毒注射总量（vg）=6 × 10¹³ vg/kg x 0.025kg =1.5 × 10¹² vg；

注射用的病毒工作液浓度（vg/µL）= 1.5 × 10¹² vg/小鼠 / 200µL/小鼠 = 7.5 × 10⁹（vg/µL）；

本次注射需要用到的AAV病毒总量（vg）= 7.5 × 10⁹ （vg/µL）x (200µL+15µL) = 1.6125 x 10¹²vg；

需要加入的病毒原液体积（µL）= 1.6125 x 10¹²vg/3 x 10¹³vg/mL x 1000µL/mL = 53.75 µL

配制病毒工作液需要加入的无菌PBS体积（µL） = 215µL – 53.75 µL = 161.25 µL

小技巧：

• 最终配液体积 = 实际注射量 + 15 µL（针头堵塞 + 移液误差）。
• 确保最终注射体积 ≤ 最大允许体积。

e.AAV注射前的配液操作步骤

注意：须严格遵守本机构的生物安全及个人防护装备（PPE）规范。在一个无菌、RNase& DNase free的1.5 mL EP中，根据步骤d的计算结果，用AAV原液和无菌PBS配制注射用AAV。始终将AAV原液及注射用AAV置于冰上。使用洁净的微量移液器和全新移液器吸头盒，以确保无菌。按照本机构的废弃物管理规范，丢弃接触过AAV的移液器吸头。

将AAV原液置于冰上解冻。

注意：建议根据单次实验用量将 AAV 原液分装为小份，例如 10–50 µL 或 50–100 µL，避免反复冻融。

2.注射台准备

a.清洁：用70%乙醇（EtOH）擦拭工作台面。用水和洗洁精清洗小鼠固定管（可用50mL离心管改造）。将一支洁净的空15 mL锥形管放入管架/管座。在工作台上放置一个加高平台，用于摆放小鼠固定管。

静脉注射台全景示意。(A) 行静脉注射所需工具。图中包括：(1) 计时器，(2) 小鼠固定管，(3) 未剪塑料固定锥，(4) 自制的塑料固定锥，(5) 酒精棉片，(6) 用作加高平台的空吸头盒，(7) 一次性吸水垫，(8) 装有温水的15 mL锥形管，(9) 15 mL管架，(10) 纱布，(11) 胰岛素注射器。(B) 先将小鼠放入固定管；若小鼠体型过小，仅靠固定管无法稳固，则插入自制的固定锥形成限位套筒。务必确保小鼠呼吸不受限。将固定管置于加高平台上，以便将鼠尾浸入温水中。(C) 注射前鼠尾摆放与持针角度：向后拉直鼠尾，使注射部位完全水平；针头与鼠尾及静脉平行，针尖斜面朝上。

图片来源：https://app.jove.com/v/66934/author-spotlight-developing-gene-therapies-for-muscular-dystrophies

将清洁后的小鼠固定管置于工作区内。若待注射小鼠明显小于现有固定管，可使用塑料小鼠固定锥制作限位套筒。

在工作区摆放注射用注射器，使用 0.3 mL 胰岛素注射器，配 29 G 针头。来回推拉每支注射器的活塞数次，确保其移动顺畅无阻力；若活塞运行不畅，立即弃用并更换新注射器。

将废物容器尽量靠近注射台，以便立即丢弃被 AAV 污染的工具。

在注射区旁准备小鼠电子秤和迷你离心机。

将已配制好的 AAV 置于冰上，并放在注射区内备用。

准备 38–40 °C 的温水；注意水温不得超过 40 °C，以免烫伤鼠尾

3.注射操作步骤

a.称量每只小鼠体重，按 vg/kg 计算剂量。提取小鼠尾巴，将其放在鼠笼盖上，进行适当安抚。然后将小鼠装入固定器，盖紧盖子，使其尾巴朝外露出。

b.将 15 mL 锥形管装满温水。将装有小鼠的固定管放到加高平台上，把小鼠的尾部长段浸入温水中，至少 1 min，直到两侧静脉明显扩张并清晰可见（也可用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其血管扩张）。

c.在尾温扩张期间，将 AAV 工作液吸入注射器。 将已开盖的含 AAV 的 1.5mL EP放入管架。垂直插入针头(垂直进针可防止管壁损伤针头)，避免针头触碰管壁，用手握住管体。将管与注射器同时抬至眼平高度，双臂置于桌面稳定；缓慢吸取所需剂量（缓慢抽吸可防止细小气泡附着于注射器壁），排出气泡。将注射器静置 ≥40 s，使注射液升温。

注意：注射液必须接近体温，如过冷，除最初几微升外，其余难以进入静脉。

d.每分钟检查尾静脉一次，注意静脉必须全部清晰可见；若不够明显，可延长温水浸泡时间并更换新温水。

e.确认静脉清晰后，将固定管从加高平台取下，直接放于桌面。使小鼠头朝前、脚朝下（而非侧向），便于操作鼠尾。注意：小鼠不能侧卧或仰卧；必须完全固定，无法移动、旋转或抽动尾巴。

f.迅速用纱布擦干鼠尾 → 再用酒精棉片擦拭 → 再用干纱布擦干。注意：用干纱布使鼠尾微湿即可，过干反而不易看清静脉。

g.将鼠尾向左或向右旋转约 90°，使两条侧静脉中的一条朝上。在尾中三分之一段内寻找合适的注射点。首次注射应先从远端（靠近尾尖）开始；如需再次注射，则逐步向近端移动。注意：绝不可在先前注射点的远端再次尝试，否则药液可能从旧针孔渗漏。每侧尾静脉的失败尝试不得超过 3 次，以免给小鼠造成过度应激或剂量不准。

h.用左手的拇指和食指在注射点远端握住鼠尾，将鼠尾绕过食指，使注射点平贴于食指指腹。向后牵拉鼠尾，使尾完全伸直且注射部位呈 0° 水平（与桌面平行）（上图 C）。

i.用右手食指和中指夹住注射器筒翼两侧，拇指置于活塞上，随时准备推注。将双手置于桌面以保持稳定；将针头平行于尾及静脉放置，斜面朝上，并紧贴按住尾部的食指，以增强注射点的控制与稳定。

j.保持针头与静脉平行，同时轻轻向下施压，将针头滑入静脉。注意：向下的压力应恰好使针头以合适角度刺入静脉。尾静脉极浅，因此进针时应尽量保持针头与尾表面平行。

k.缓慢将药液注入静脉。注射完毕后，缓慢退针，并立即用棉球在注射点按压至少 1min 以止血。

注意：持续按压直到出血完全停止。拔针后通常会有血滴出现，说明针头曾刺穿静脉；但偶尔即使注射成功也无血滴。血滴仅提示针头进入过静脉，并不能作为注射成功的可靠指标。真正的成功注射标志是推注活塞时毫无阻力：若针头位于静脉内，推注过程中活塞应顺滑无阻，且注射点近端的静脉会瞬间颜色变浅（变白）（部分品系小鼠静脉变白不明显）。若感到阻力或注射部位出现隆起，则说明针头未正确进入静脉。此时应将针头完全退出鼠尾，并在失败点近端（更靠近鼠体）选择新的注射位点重新尝试。

l.松开固定装置，将小鼠放入新的笼盒，与未注射小鼠分开；注射后连续观察 10 min，确认其活动正常。

k.使用 70% 乙醇对工作台面进行消毒。

图片来源：https://research.unc.edu/wp-content/uploads/2021/06/mouse-class-handout.pdf箱注册之后才能观看）