慢病毒包装过程中的常见问题

通过MOI计算。MOI(Multiplicity of Infection，感染复数)是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高，证明细胞越难被感染。一般我们把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。

相关计算公式：

每孔所加病毒量(μL)=MOI×细胞数/病毒滴度(TU/mL)×1000

MOI=(病毒滴度×病毒体积)/细胞数目

病毒滴度可通过荧光计数法进行确定。

2、慢病毒感染细胞，铺板密度是多少？

通常根据细胞增殖的速度调整细胞铺板密度，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。

针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右;

针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70~80%左右;

针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

3、向细胞中加入慢病毒的最佳时间是什么时候？

一般慢病毒感染细胞后可在2~3天观察到所携带基因的荧光表达情况，即在细胞状态良好，汇合度为30~50%时加入慢病毒，以确保在感染后2天时细胞增长达到70%左右的汇合度，即是最佳时间。

4、慢病毒感染细胞后基因表达多久到达峰值？

慢病毒感染后大部分细胞GFP或目的基因的表达在3天左右达到峰值，但若是细胞生长缓慢，达到峰值的时间就会延长。

5、慢病毒感染细胞后为什么GFP荧光信号弱？

一般与进入宿主细胞内慢病毒颗粒数较少、自身的增殖状态较差、细胞种类、观察时间较早、目的基因表达或者特殊结构等因素有关。一般慢病毒感染细胞3天左右荧光信号最强。

6、慢病毒包装出毒量很低？

可能与以下几个方面有关：

(1)细胞状态：一般293T细胞的活力、增殖状态、铺板密度、是否处于对数生长期等对病毒的产量影响很大。

(2)质粒提取的质量：若出现纯度不高、浓度过低、未去除内毒素、目的基因载体构建的不完整等均会导致包装出毒量很低。

(3)目的基因：目的基因的片段大小、序列及翻译的蛋白是否含有毒性均会影响包装效果。目的基因片段过大(>2.5k)可能会导致包装滴度下降，甚至无法包装。目的基因翻译的蛋白产生细胞毒性，可能会导致细胞增殖异常以至于包装出毒量很低。

(4)收毒时间：收毒时间过早，会导致出毒量很低。一般在转染后24h观察细胞生长状态和荧光信号强弱，若细胞生长状态良好，第一次可在48h收集病毒上清，第二次可在换液后72h收集病毒上清。

7、慢病毒感染细胞效率低？

可能与以下因素有关：

(1)细胞类型：某些原代细胞和干细胞自身较难转染，导致慢病毒感染细胞效率低，可加大病毒量或采用浓缩病毒进行感染。

(2)细胞生长状态：细胞感染前生长状态异常，如存在支原体污染、细胞铺板密度过大等。

(3)病毒质量：慢病毒滴度不高，操作时应尽量避免冻融，建议分装储存于-80℃。