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慢病毒服务

AAV Packaging Services

慢病毒载体(Lentivirus vector)是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应。派真生物提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

派真生物提供丰富的慢病毒产品，用于操作编码基因和非编码基因，如lncRNA、microRNA、circRNA等。

服务内容

服务类别 定制总量 滴度 周期
细胞级慢病毒包装 5E+7TU ≥1E+8TU/mL 7~12个工作日
1E+8TU ≥1E+8TU/mL 7~12个工作日
5E+8TU ≥1E+8TU/mL 10~20个工作日
1E+9TU ≥1E+8TU/mL 10~20个工作日
动物级慢病毒包装 5E+7TU ≥1E+8TU/mL 7~12个工作日
1E+8TU ≥1E+8TU/mL 7~12个工作日
5E+8TU ≥1E+8TU/mL 10~20个工作日
1E+9TU ≥1E+8TU/mL 10~20个工作日
备注：

1、细胞级慢病毒包装推荐用于细胞实验；动物级慢病毒包装推荐用于动物实验。

2、对包装过程有不利影响的基因（例如毒性基因，破坏包装细胞完整性的基因，破坏慢病毒RNA基因组完整性的序列，易于重排或者产生二级结构的序列等）、核蛋白、跨膜蛋白、受体基因和LTR之间（不含LTR）片段≥6.5kb的慢病毒定制包装不保证产量。

3、下单免费赠送10%荧光对照病毒。

      服务优势 

    1、快速：1E+8TU以内最快可在7个工作日交付；

    2、可靠：交付滴度≥1E+8TU/mL，不担心滴度虚高，滴度最高可达1E+9TU/mL；

    3、周到：及时响应式专业技术支持服务，定制病毒包装服务附赠10%的荧光对照病毒；

    4、免邮：货物干冰低温运费均由派真生物承担；

    5、全面：提供从载体设计、病毒包装到分析检测的一站式服务。

    慢病毒包装流程

    慢病毒质控

    1、多重酶切鉴定生产病毒所用质粒(常规质控)

    2、梯度稀释感染细胞，计数荧光细胞以测定病毒滴度(适用于表达荧光蛋白的定制慢病毒)；

    3、感染细胞，定量qPCR测定慢病毒滴度(适用于不表达荧光蛋白的定制慢病毒)

    实验设计参考

    • 慢病毒感染MOI计算
    病毒液体积=细胞数 × MOI/病毒滴度

    举例:滴度1×10^8 TU/mL的慢病毒感染HEK293细胞所用培养基体积和病毒量；假如24孔板细胞接种量是5×10^4； 6孔板细胞接种量为2×10^5个T25瓶细胞接种量是5×10^5个。

    单孔底面积 正常培养体积 感染时体积 MOI=10加病毒量 MOI=100加病毒量
    24孔板 2cm² 500 μL 250μL 5μL 50μL
    6孔板 10cm² 2mL 1mL 20μL 200μL
    T25瓶 25cm² 5mL 2mL 50μL 500μL
    • 慢病毒感染MOI预实验步骤:
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    第一天：铺板，设置MOI梯度，可以按照MOI为2.5，5，10，20，40，80或者自行根据实际情况设置梯度。同时设置一个空白对照组，用来判定细胞状态。注：建议设置一组复孔，如下图所示：

    空白组 MOI=2.5 MOI=5 MOI=10 MOI=20 MOI=40 MOI=80
    空白组 MOI=2.5 MOI=5 MOI=10 MOI=20 MOI=40 MOI=80
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    细胞接种：一般24孔板每孔接种 3~5×10^4个细胞：如果细胞特别大可以适当减少，特别小可以适当增加；原则上建议第二天融合度约30~40%最佳。
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    感染：细胞接种后第二天加入慢病毒：按照设置的MOI算好每孔加的病毒量。慢病毒感染细胞可以加polybrene来增加感染效率，终浓度为5ug/ml，轻轻摇匀后，放回培养箱继续培养；
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    换液：感染后8~20小时后，提前37°C预热培养基，弃去含有病毒的培养基，加入新鲜培养基，放回培养箱继续培养。
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    检测并确定合适的MOI值：在荧光显微镜下观察荧光表达情况或者通过qPCR检测目的基因的表达，来判断选择合适的MOI进行慢病毒感染实验。
    • 慢病毒体外感染操作步骤

    以24孔板为例，进行目的细胞感染预实验，按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据公式算出所需病毒量，如有必要可用无血清培养基稀释病毒原液。

    • 贴壁感染
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    第一天，准备细胞：24孔板接种若干孔细胞，每孔接种约3~5×10^4个细胞，每孔培养基体积500μL; 进行病毒感染时，细胞融合度大约30~50%。
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    第二天，准备病毒并感染细胞：－80°C冰箱取出病毒先在冰上融化或者4°C融化，根据算好加入的病毒量稀释到培养基中，尽可能保证含有慢病毒的培养基为最小体积，以获得最佳感染效果；
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    更换培养基：一般感染8~20h后将含有病毒的培养液更换为新鲜培养基，感染后注意观察细胞状态，如果慢病毒感染对细胞有明显毒性而影响到细胞状态，则建议在加入病毒4~6h后，更换新鲜培养基。
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    感染效率检测：一般感染48~72h后，在倒置荧光显微镜下观究光，估计慢病毒感染目的细胞的效率：如果慢病毒没有带荧光标记则可通过qPCR检测目的基因的表达来评估感染效率。
    注意：慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后72h后再观察荧光表达以判断感染效率；感染期间请根据细胞生长状态，对细胞进行及时换液以保证良好的生长状态。
    • 悬浮感染
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    接种适量胰酶消化后(或悬浮状态细胞，以在第二天密度约40%为宜。按计算所需要病毒体积，加入相应体积的培养基中，混匀。

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    更换培养基：加入病毒感染16小时后换液（若病毒对细胞状态影响不大，可48小时后再换液）。

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    感染效率检测：一般感染48~96小时后观察荧光，或者根据病毒裁体设计加入相应药物筛选。
    常见细胞感染MOI

    细胞名 细胞中文名 慢病毒感染（MOI） Puromycin参考值
    5637 人膀胱癌细胞 10 2ug/ml
    293T 人胚肾上皮细胞 5 2ug/ml
    A172 人胶质母细胞瘤细胞 10 2ug/ml
    A549 人非小细胞肺癌细胞 10 2ug/ml
    BEL-7402 人肝癌细胞 10 2ug/ml
    BGC-823 人胃癌细胞 50 2ug/ml
    Ca Ski 人宫颈癌肠转移细胞 10 2ug/ml
    Caki-1 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞 10 2ug/ml
    CAL 27 人舌鳞癌细胞 20 2ug/ml
    DU 145 人前列腺癌细胞 20 2ug/ml
    F98 大鼠脑胶质瘤细胞 20 2ug/ml
    GES-1 人胃上皮细胞 20 2ug/ml
    H1299 人非小细胞肺癌细胞 10 2ug/ml
    HCT 116 人结肠癌细胞 10 2ug/ml
    Hela 人宫颈癌细胞 10 2ug/ml
    Hep 3B 人肝癌细胞 10 2ug/ml
    HepG2 人肝癌细胞 10 2ug/ml
    HL-60 人原髓细胞白血病细胞 10 2ug/ml
    HT-29 人结肠癌细胞 10 2ug/ml
    K-562 人慢性髓原白血病细胞 10 2ug/ml
    LoVo 人结肠癌细胞 50 2ug/ml
    MADB-106 大鼠乳腺癌细胞 20 2ug/ml
    MCF-7 人乳腺癌细胞 20 2ug/ml
    MDA-MB-231 人乳腺癌细胞 10 2ug/ml
    MGC80-3 人胃癌细胞 10 2ug/ml
    MHCC-97H 人肝癌细胞（高转移） 10~20 2ug/ml
    NCI-H1299 人非小细胞肺癌细胞 20 2ug/ml
    PC14 人肺癌细胞 10 2ug/ml
    PC9 人肺癌细胞 5 2ug/ml
    RKO 人结肠腺癌细胞 10 2ug/ml
    RWPE-1 人正常前列腺上皮细胞 20 2ug/ml
    SH-SY5Y 人神经上皮瘤细胞 20 2ug/ml
    U-118 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10 2ug/ml
    U251 人胶质瘤细胞 5 2ug/ml
    U266 人骨髓瘤细胞 20 2ug/ml
    U-87 人脑星形胶质母细胞瘤细胞 5 2ug/ml

    过表达慢病毒

    LV-基因过表达（XL系列）

    载体编号 外源启动子 建议基因容量 启动子 筛选标签
    XL01C CMV 5 Kbp 无 无
    XL02C CMV 4Kbp PGK Puro
    XL03C CMV 3.3Kbp EF1 CopGFP-2A-Puro
    XL04C CMV 4Kbp EF1 mCherry
    XL05C CMV 4Kbp IRES Neo
    XL06C CMV 4Kbp EF1 copGFP
    XL07C CMV 4.3 Kbp 无 2A-Neo
    XL08C EF1 3.3Kbp CMV CopGFP-T2A-Puro
    XL09C EF1 3.2Kbp CMV C-3xflag、CopGFP-T2A-Puro
    XL10C CMV 4Kbp EF1 mRuby2
    XL11C CMV 4Kbp EF1 mCitrine
    XL12C CMV 4Kbp EF1 EYFP
    XL13C CMV 4Kbp EF1 Neo,CopGFP
    XL14C CMV 3.3Kbp EF1 EGFP-2A-Neo
    XL15C CMV 2.7Kbp EF1 C-3xFlag、CopGFP-T2A-Puro
    XL16C EF1 3.2Kbp CMV N-3xflag、CopGFP-T2A-Puro
    XL17C EF1 3.9Kbp CMV C-3xFlag、CopGFP
    XL18C CMV / C-3xFlag、Puro
    XL19C CMV / dTomato-T2A-Puro
    XL20C CMV / CopGFP
    XL21C CMV / CopGFP-T2A-Puro
    XL22C CMV EF1 mCherry-2A-Neo

     (上下滚动查看更多）

    特点：

    • 成熟高效表达载体，适用于多种实验设计；
    • 可用GFP、mCherry、Puro、Neo等作为筛选标记。

    shRNA干扰慢病毒

    LV-shRNA干扰（XL系列）

    派真生物XL系列可定制克隆您的靶标序列shRNA，用于高效敲降培养细胞中的靶基因表达水平。可形成发夹结构的shRNA可在U6或H1启动子驱动下表达，并同时用CMV/EFla等启动子驱动表达GFP绿色荧光蛋白作为跟踪蛋白。

    载体编号 启动子 基因 标记／筛选基因
    XL01B U6启动子 CMV copGFP
    XL02B Hl启动子 CMV CopGFP-2A-Puro
    XL03B U6启动子 EF1a EGFP-2A-Neo
    XL04B U6启动子 CMV copGFP-2A-Puro
    XL05B U6启动子 CMV Puro
    XL06B U6启动子 PGK Puro.lRES.mCherry
    XL07B H1启动子 CMV copGFP
    XL08B H1启动子 CMV CopGFP-2A-Puro
    XL09B H1启动子 CMV Puro
    XL012B U6启动子 CMV Neo

     

    miRNA过表达/抑制慢病毒

    miRNA过表达/抑制质粒

    派真生物提供定制miRNA抑制的AAV载体，可直接用于抑制miRNA的功能并调节miRNA在活体动物中的表达。这是活体动物基因研究的常用方法。

     

    类型 载体编号 启动子 报告基因
    miRNA过表达 XM07 H1 maxGFP
    miRNA抑制 XM03 U6 maxGFP
    XM04 U6 EGFP
    XM08 H1 EGFP