一、包装阶段常见问题
1. 包装效率低或无病毒产生
可能原因：
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转染效率低（细胞状态不佳或转染试剂问题）
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质粒比例不合适（一般 transfer: packaging: envelope = 4:3:1 或 2:1:1）
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质粒质量差（内毒素含量高、浓度过低）
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细胞过度融合或密度过高（推荐70–80%融合时转染）
解决建议：
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使用新鲜、活性良好的HEK293T细胞
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优化质粒比例和转染剂量
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使用高纯度内毒素去除质粒
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确认各质粒构建正确（尤其是env和gag/pol质粒）
2. 病毒滴度低
可能原因：
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上清收集过早（推荐48–72 h收集）
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病毒降解或吸附到细胞上
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浓缩或过滤过程导致损失
解决建议：
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优化收集时间点
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使用低吸附离心管或滤膜
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必要时采用PEG沉淀或超速离心浓缩
二、感染阶段常见问题
1. 感染效率低或无荧光信号
可能原因：
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目标细胞不易感染（例如非分裂细胞对病毒敏感性差）
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MOI过低
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病毒储存不当（冻融多次导致失活）
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转导助剂（如Polybrene、DEAE-Dextran）未使用或浓度不合适
解决建议：
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提高MOI或重复感染
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使用适当的转导增强剂（如Polybrene 4–8 µg/mL）
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优化细胞密度（50–70%融合度最佳）
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确认报告基因表达系统是否正常
2. 细胞死亡率高
可能原因：
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病毒滴度过高（毒性效应）
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Polybrene浓度过高
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目的基因本身具有毒性
解决建议：
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降低MOI或缩短暴露时间
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优化Polybrene浓度
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采用诱导表达系统（如Tet-On）
三、检测与稳定株筛选阶段
1. 荧光延迟出现
原因：
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慢病毒整合表达需时间（一般48–72 h后明显）
建议：
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72–96 h后再检测荧光或进行抗生素筛选
2. 病毒长期保存后失活
可能原因：
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反复冻融或储存温度不当
建议：
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分装后储存于 –80°C，避免多次冻融
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使用冷冻保护剂（如10%甘油）
四、其他常见注意事项
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慢病毒为 二级生物安全等级（BSL-2） 病毒，操作需在生物安全柜内进行
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避免直接接触和气溶胶吸入
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所有废弃物需高压灭菌后处理
关于派真
作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。
凭借我们独立知识产权的π-alphaTM 293 细胞AAV高产技术平台，我们能将AAV产量提高多至10倍，每批次产量可达1×10¹⁷vg，以满足多样化的商业化和临床项目需求。此外，我们定制化的mRNA和脂质纳米颗粒（LNP）产品及服务覆盖药物和疫苗开发的各个阶段，从研发到符合GMP的生产，提供端到端的一站式解决方案。
