慢病毒（Lentivirus）包装的四质粒系统（4-plasmid system）是目前常用的一种高安全性、高效率的包装方式，用于生产第三代慢病毒载体。相比早期的三质粒系统，它通过进一步分离病毒的功能基因，显著降低了重组产生复制型病毒（RCL，Replication-Competent Lentivirus）的风险。
一、四质粒系统的组成
四质粒系统通常包括以下四个质粒：
| 质粒类别 | 质粒名称（示例） | 功能说明 |
| 1. 转移载体（Transfer vector） | pLVX, pLenti, pCDH 等 | 携带目的基因（GOI, Gene of Interest）及调控元件（如启动子、荧光/抗性基因等）。这是最终进入宿主细胞的载体。 |
| 2. 包装质粒（Packaging plasmid） | pMDLg/pRRE（或 pGag/Pol） | 提供结构蛋白 Gag 和逆转录酶、整合酶等 Pol 蛋白，负责病毒核心的形成与基因组整合。 |
| 3. Rev 质粒 | pRSV-Rev 或 pCMV-Rev | 提供 Rev 蛋白，促进病毒 RNA 的核输出和包装。第三代系统中 Rev 被单独表达以提高安全性。 |
| 4. 包膜质粒（Envelope plasmid） | pMD2.G（或 VSV-G） | 提供 VSV-G 糖蛋白，使病毒获得广泛的宿主细胞感染能力。 |
二、包装原理
在 HEK293T 等高转染效率细胞中共同转染以上四个质粒后：
1.Gag/Pol、Rev、VSV-G 等辅助蛋白由包装质粒表达；
2.转移载体上的目的基因 RNA 被这些蛋白包装进病毒颗粒；
3.形成的慢病毒颗粒被分泌到培养上清中；
4.收集上清，即可用于感染靶细胞。
三、三质粒系统与四质粒系统的区别
| 特点 | 三质粒系统 | 四质粒系统 |
| 质粒数量 | 3 个 | 4 个 |
| Rev 基因 | 与 Gag/Pol 同载体 | 独立成单独质粒 |
| 安全性 | 高 | 更高（避免RCL产生） |
| 常见载体组合 | psPAX2 + pMD2.G + 转移载体 | pMDLg/pRRE + pRSV-Rev + pMD2.G + 转移载体 |
四、应用与优势
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适合科研用基因过表达、敲降（shRNA/siRNA）、CRISPR 等项目；
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具有较高的滴度和较好的稳定性；
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安全等级高（第三代系统中已删除大部分病毒复制相关基因）。
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