病毒包装全流程详解：从有没有目的基因到启动子、标签与毒性评估

在进行慢病毒或 AAV 病毒包装前，很多实验失败、周期延长或反复返工，其实都源于前期信息不完整或关键决策没有提前考虑清楚。本文将从实际项目操作角度，系统梳理病毒包装的完整流程与关键决策点，帮助科研人员或项目负责人高效推进病毒构建与包装工作。

一、明确实验目的：所有设计的起点

病毒包装的第一步，并不是选载体或谈滴度，而是明确实验目的，包括：

1.操作类型

• 过表达
• 敲降（shRNA / miRNA）
• 敲除（CRISPR-Cas9）

2.使用场景

• 体外细胞实验
• 动物体内（in vivo）

3.表达需求

• 强表达 or 温和表达
• 短期 or 长期表达

实验目的不同，将直接影响后续的病毒类型、启动子选择、载体结构设计。

二、是否已有目的基因序列或质粒（关键分叉点）

这是病毒公司或代理最先确认的问题，因为它直接决定项目周期和成本。

1. 已有过表达质粒（最理想）

• 可直接用于病毒包装

• 周期最短、成本最低

• 风险最小

通常只需提供质粒 map 或序列文件。

2. 有 CDS 序列，但未构建病毒载体

• 需要进行载体克隆

• 需确认是否进行密码子优化

• 可在此阶段加入标签或表达调控元件

项目周期和费用处于中等水平。

3. 只有基因名，没有序列（最常见）

• 需要进行

  • CDS 设计

  • 人工基因合成

  • 病毒载体构建

• 必须明确基因物种来源

三、载体设计：病毒成功的核心环节

1. 启动子（Promoter）选择

启动子决定表达强度、稳定性以及细胞/组织特异性。

启动子	特点	常见应用
CMV	强表达	体外细胞
EF1α	稳定	长期表达 / in vivo
PGK	温和	毒性或敏感基因
CAG	强且稳定	动物实验
组织特异性启动子	精准	特定细胞/组织

对于潜在毒性基因，应避免使用 CMV 等强启动子。

2. 标签（Tag）设计

标签用于检测、定位或筛选表达细胞，常见包括：

• 小标签：Flag、HA、Myc

• 荧光标签：GFP、mCherry

• 共表达系统：IRES、P2A

需要提前确认：

• 标签位于 N 端还是 C 端

• 是否可能影响蛋白功能或定位

3. 基因物种（Species）确认

病毒载体中的 CDS 必须与目标物种一致，例如：

• Human

• Mouse

• Rat

病毒本身不具备“自动跨物种表达”能力，物种选错会导致表达失败。

4. 毒性评估（非常关键）

部分基因在过表达时可能对包装细胞或目标细胞产生毒性，包括：

• 转录因子

• 凋亡相关蛋白

• 激酶、离子通道蛋白

• 本身表达水平极高的基因

可能带来的问题：

• 病毒滴度显著下降

• 包装效率低甚至失败

• 感染后细胞大量死亡

常见解决策略：

• 选用弱或可控启动子

• 使用 Tet-on 诱导系统

• 降低 MOI 或表达水平

四、质粒构建与验证

标准流程包括：

1. 基因合成或克隆

2. 转化与筛选

3. 序列验证（Sanger 或 NGS）

4. 质粒放大与纯化

对于高要求实验或临床前研究，通常还需：

• 全长测序

• 内毒素水平控制

五、病毒包装阶段

慢病毒（Lentivirus, LV）

包装细胞：HEK293T

特点：

• 基因可整合
• 适合体外实验和分裂细胞

AAV

包装系统：HEK293 或 Sf9

特点：

• 非整合
• 更适合 in vivo 实验

六、病毒质量控制（QC）

常见检测项目包括：

• 病毒滴度（TU/mL 或 vg/mL）

• 空壳率（AAV）

• 内毒素

• 支原体

• 表达功能验证（可选）

七、交付与使用前注意事项

在实际使用前，还需关注：

• 病毒保存条件

• 冻融方式

• 推荐 MOI 或给药剂量

• 适配的细胞或动物模型