1️⃣ 什么是慢病毒载体，它能做什么？
慢病毒（Lentivirus） 是以 HIV-1 为基础改造而成的自我灭活（SIN）病毒载体，可高效感染分裂/非分裂细胞，并将外源序列稳定整合到宿主基因组，实现长期表达。
主要应用
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基因过表达（ORF、FLAG/HA/GFP 融合）
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基因敲低（shRNA / embedded miR-30）
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CRISPR 基因编辑（KO、KD、CRISPRa/i）
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报告系统（GFP、mCherry、Luciferase）
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条件表达（Tet-On / Tet-Off、Cre-ER）
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体内/体外谱系追踪、CAR-T、iPSC 建系等
安全提示：整合偏好转录活跃区（TSS 附近），存在插入突变风险；动物或临床前实验需检测整合拷贝数与 replication-competent lentivirus (RCL)。
2️⃣ 如何设计慢病毒载体？
① 明确实验目的 → 选载体骨架与启动子
② 插入片段设计
② 插入片段设计
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过表达：CDS ≤3 kb 最稳；>5 kb 需评估滴度
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敲低：1–3 条 shRNA；推荐 miR-30 骨架（Pol-II 驱动，毒性低）
- CRISPR：
– 双病毒：U6-sgRNA + EF1α-Cas9
– all-in-one：U6-sgRNA-EF1α-Cas9-P2A-Puro（~7.8 kb），>8 kb 滴度骤降
③ 启动子选择
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强通用：CMV、CAG
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稳定中等：EF1α、PGK
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组织特异：TBG（肝）、SYN（神经）、CD68（巨噬）等；强度低可加增强子或合成启动
④ 功能模块
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筛选标记：Puromycin、Blasticidin、Neomycin
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荧光：GFP、mCherry、BFP
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元件增强：WPRE（±50 % 表达提升）
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多基因共表达：P2A、T2A、IRES（注意长度）
⑤ 长度控制
病毒 RNA（5′LTR→3′LTR）≤8 kb 较稳；>9 kb 基本包不出来。设计时把骨架+插入+标记全部计算，预留 0.3–0.5 kb 余量。
病毒 RNA（5′LTR→3′LTR）≤8 kb 较稳；>9 kb 基本包不出来。设计时把骨架+插入+标记全部计算，预留 0.3–0.5 kb 余量。
3️⃣ 慢病毒包装系统与流程
第三代 四质粒系统
| 质粒 | 功能 |
| Transfer plasmid | 含目的基因、ψ 包装信号、SIN LTR |
| Packaging (gag/pol) | 结构蛋白与逆转录酶 |
| Rev | 促进病毒 RNA 出核 |
| Envelope (VSV-G) | 广嗜性膜蛋白 |
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包装细胞：HEK293T 或 HEK293FT
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收集与纯化：48–72h 收集上清，过滤，必要时可浓缩（超速离心、PEG 或 TFF）
4️⃣ 如何确定病毒滴度与质量？
滴度检测方法：
- 功能滴度（TU/mL）—最推荐
- qPCR（拷贝数）
- p24 ELISA
其他质控：
- 无菌、支原体检测
- 内毒素检测（动物实验或体外应用）
5️⃣ 慢病毒使用常见问题
| 问题 | 解答 |
| 能感染哪些细胞？ | 分裂/非分裂均可；原代神经元、DC、HSC、iPSC 常用。 |
| 整合位点安全吗？ | 偏好 TSS，长期培养或体内实验建议 LM-PCR 评估拷贝数与 hotspot。 |
| 插入多大合适？ | ≤8 kb 稳；>9 kb 基本失败。 |
| 有毒基因怎么办？ | 1. Tet-On 诱导表达；2. 低强度启动子；3. miR-30 骨架降 shRNA 水平；4. 浓缩后低 MOI 感染。 |
| 如何选择 MOI？ | 新细胞先做梯度（0.1–50）；原代细胞 1–10，肿瘤细胞 0.5–5；过表达可低，CRISPR 需高。 |
| 是否需要浓缩？ | 96 孔小体积可不浓缩；24 孔以上、体内注射、高 MOI 必须浓缩（超速离心/PEG）。 |
| 冻融影响滴度吗？ | 每次损失 20–40 %；分装后 –80 °C 一次性使用。 |
6️⃣ 我们的慢病毒服务特色
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支持 过表达 / 敲低 / CRISPR 等多种功能载体
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可提供 科研级病毒包装和滴度优化
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全程 质控严格，可提供 TU/mL 功能滴度报告
关于派真
作为一家专注于AAV 技术十余年，深耕基因治疗领域的CRO&CDMO，派真生物可提供从载体设计、构建到 AAV、慢病毒和 mRNA 服务的一站式解决方案。凭借深厚的技术实力、卓越的运营管理和高标准的服务交付，我们为全球客户提供一站式CMC解决方案，包括从早期概念验证、成药性评估到IIT、IND及BLA的各个阶段。
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