如果aav包装后，感染都是backbone

AAV 包装完成并感染细胞后，检测到的主要是 backbone 相关信号（如抗性基因、非预期表达），而目的基因无表达或极低表达。

📌 这种情况绝大多数不是感染效率问题，而是载体结构、包装模板或检测环节存在系统性错误。

一、最常见的原因分析（按发生频率排序）

1️⃣ ITR 与表达盒结构异常（最常见原因）

典型表现

• 感染后仅检测到 backbone 信号

• 目的基因无转录或无蛋白表达

可能原因

• ITR 被截断、突变

• 表达盒方向反向

• 目的基因未完整位于 ITR–ITR 区间内

排查建议

• 使用 ITR-F / ITR-R 进行 PCR 验证

• 对 ITR-转基因连接区进行测序确认

解决方案

• 重新构建载体

• 选用 已验证 ITR 完整性的标准 AAV 骨架

2️⃣ Backbone 被错误包装为主要模板

典型表现

• qPCR 显示病毒滴度很高

• 实际功能滴度极低或无效

可能原因

• ITR 外侧序列被误包装

• backbone 含有可被包装的信号或强二级结构

排查建议

分别使用

• 目的基因特异引物
• backbone 特异引物
  进行 vg 定量对比

解决方案

• 优化载体设计，避免 ITR 外存在可包装序列

• 使用规范的 AAV 表达载体结构

3️⃣ 目的基因表达盒本身无法正常表达

典型表现

• AAV 感染后无表达

• backbone 报告基因或背景信号存在

常见原因

• 启动子不适用于当前细胞或物种

• Kozak 序列缺失或 ATG 错误

• ORF frame shift 或 polyA 异常

排查建议

• 将质粒直接转染细胞，确认是否能正常表达

解决方案

• 更换合适的启动子

• 重新优化表达盒结构

4️⃣ 包装质粒污染或体系混入错误质粒

典型表现

• 不同批次结果差异大

• 阴性对照中出现 backbone 信号

排查建议

• 包装前对所有质粒进行

  • 限制性酶切

  • 关键区域测序确认

• 排查是否混入历史项目质粒

解决方案

• 严格分项目操作

• 使用高质量、无内毒素质粒进行包装

5️⃣ 检测方法本身只“看到了 backbone”

典型表现

• qPCR / WB / IF 仅显示 backbone

• 实际目的基因可能未被正确检测

排查建议

• 检查 qPCR 引物是否设计在 backbone 区域

• 确认抗体是否识别的是 backbone tag

解决方案

明确区分

• 病毒结构检测（vg）
• 功能表达检测（RNA / 蛋白）

6️⃣ 重组或截短 AAV 占比过高

典型表现

• 病毒可进入细胞

• 仅残留小片段表达

可能原因

• 插入片段接近或超过 AAV 容量

• 重复序列或不稳定结构较多

排查建议

• Southern blot 或 NGS（如条件允许）

解决方案

• 控制 AAV 总长度 < 4.7 kb

• 尽量减少重复元件

二、快速排查 Checklist（推荐顺序）

1. 质粒直接转染是否能表达目的基因？

2. 目的基因是否完整位于 ITR–ITR 内？

3. vg 定量：目的基因 vs backbone 比例是否异常？

4. 检测引物 / 抗体是否选错？

5. ITR 是否存在截断或方向错误？