2020年，Virginijus Siksnys团队证明Cas12f在试管中可以依赖PAM进行双链DNA切割【1】。2021年，Yong-Sam Kim团队，亓磊团队和季泉江团队分别独立证明了Un1Cas12f1(537 氨基酸，识别TTT PAM)【2、3】和AsCas12f1(422 氨基酸，识别TTR PAM)的哺乳动物细胞和细菌编辑活性【4】。
为阐明如此小分子量的AsCas12f1核酸酶具有编辑活性的分子机制和提升其编辑活性，季泉江团队于2023年解析AsCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合体结构，并基于结构进行理性设计，极大提升了其基因编辑效率【5】。然而，AsCas12f1同大多数Cas12f1一样仅识别富T的PAM序列，限制了其靶向范围。因此，亟需开发新的高活性且靶向范围更广的CRISPR-Cas12f系统。Clostridium novyi Cas12f1(CnCas12f1.497氨基酸)对罕见的富C PAM序列具有识别特异性，但人们只在试管中检测到DNA切割活性，并没有发现其具有活细菌内的靶向干扰活性，并且其富C PAM的特异性识别和DNA催化切割机制亦不清晰。
2023年9月11日，上海科技大学季泉江教授团队在Nature Chemical Biology 期刊发表了题为：Molecular basis and engineering of miniature Cas12f with C-rich PAM specificity的研究论文。
该研究解析了微型基因编辑系统CRISPR-CnCas12f1的三元复合体的结构，揭示了其独特的结构特征与其识别富C PAM序列并发挥催化作用的分子机制，并通过工程化改造引导RNA，将最初没有编辑活性的CnCas12f1转化为人类细胞中高效的基因编辑工具。
研究人员利用冷冻电镜技术成功解析了CnCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合体的精细结构，揭示了复合体的形成机制，两个CnCas12f1单体以不对称二聚体的形式与引导RNA和目标DNA相互作用形成效应复合物。通过层层解析CnCas12f1二聚体的交互界面，明确了形成二聚体的关键作用力：底层主要由范德华力推动，中间两层则主要通过氢键形成，而顶层则依赖于REC识别结构域的α3螺旋间相互作用实现二聚化。
与同源酶Un1Cas12f1的复合物结构相比，CnCas12f1的REC识别域存在独特的不同于与其它Cas12f酶的延伸螺旋结构，该特殊螺旋对维持其酶活性至关重要。不仅如此，CnCas12f1与AsCas12f1类似，其sgRNA也含有一个独特的共轴RNA螺旋结构，在Un1Cas12f1中被蛋白中额外增加的锌指结构域所替代，表明Cas核酸酶的蛋白结构域与sgRNA之间存在协同进化。
该研究还阐明了CnCas12f1与靶向DNA的相互作用机制，揭示了CnCas12f1通过其识别域REC.1、楔形域WED.1和REC.2来协同识别特定的PAM序列，并通过点突变实验证实了其中5个关键氨基酸残基的重要性。同时，研究人员使用工程化CnCas12f1的“共价二聚体”进行体外切割实验，确定了CnCas12f1的DNA催化切割主要依赖RuvC.1域的活性中心，为优化Cas12f1的基因编辑应用提供了依据。
图1：CnCas12f1识别和切割DNA的分子催化机制
此外，研究人员通过体外实验对CnCas12f1的生化特性和双链DNA切割模式进行了系统的表征。证明CnCas12f1是一个依赖Mg2+且盐浓度敏感的嗜热核酸酶，能够与sgRNA结合后识别并切割含有5′-NCCD(D表示A、G和T)PAM的双链DNA，在靶向链上引入一个切口，非靶向链上引入两个切口，形成不对称粘性末端。
为了获得体内活性，研究人员通优化引导RNA的结构，设计出了一个在细菌内具有高活性的单向导RNA(sgRNA_MS1)。进一步系统地对CnCas12f1的sgRNA进行工程化设计，最终获得了在人类细胞中表达更高、编辑活性大幅提升的sgRNA_MS13.表明引导RNA的结构缺陷是限制Cas12f家族核酸酶基因组编辑活性的主要因素，为改进其他Cas核酸酶的活性提供了策略。
图2：引导RNA工程化提高CnCas12f1的基因组编辑活性
该研究又一次拓展了微型CRISPR核酸酶工具库，增进了我们对CRISPR-Cas12f家族的结构生物学理解，为开发适合病毒载体递送的高效微型CRISPR系统提供了重要参考。
值得一提的是季泉江课题组近期还开发了另外一类新颖Cas12n微型基因编辑器，具有不同于CnCas12f(C-rich)和AsCas12f1(T-rich)的AAN PAM识别特性和高效的编辑活性【6】。
上海科技大学季泉江课题组博士生苏梦娇、博士后李帆和博士后王玉珏为论文共同第一作者。上海科技大学季泉江教授与助理研究员吴兆韡为论文共同通讯作者。
资料来源
1.论文链接
https://www.nature.com/articles/s41589-023-01420-4
2.公众号生物世界
https://mp.weixin.qq.com/s/CDZdBsqCHEIt1PI9st2OpA