来自化脓链球菌的Cas9核酸酶(SpCas9)由于其高效率而得到了广泛应用。为了适应灵活的PAM要求，一种策略是开发SpCas9变体，然而，SpCas9及其变体对于单个腺相关病毒(AAV)来说太大了，这严重限制了其体内治疗应用。近年来开发的几种紧凑型Cas9核酸酶在体内基因治疗应用方面潜力巨大，但它们往往依赖更复杂的PAM序列，这导致它们在许多基因组位点无法进行编辑。
2021年3月，复旦大学王永明教授团队在 Nucleic Acids Research 期刊发表论文，开发出了一种新型紧凑型Cas9核酸酶——SlugCas9.其识别简单的NNGG PAM序列，其具有活性高、精准性高、编辑范围广、尺寸小等优点。
2023年12月5日，复旦大学生命科学学院王永明教授团队联合北京大学深圳医院郑威和郑州大学第一附属医院唐俊楠，在 Nature 子刊 Nature Chemical Biology 上发表了题为：Phage-assisted evolution of compact Cas9 variants targeting a simple NNG PAM的研究论文。
该研究证实了SlugCas9具有与当前最广泛使用的SpCas9相当的活性。研究团队还使用噬菌体辅助进化来设计SlugCas9以满足独特的PAM需求，生成了一种SlugCas9变体——SlugCas9-NNG，其可识别NNG PAM序列，扩大了靶向范围。研究团队进一步开发了基于SlugCas9-NNG的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)——SlugABE-NNG，并证明了它可以由单个腺相关病毒载体(AAV)递送。
该研究开发的SlugCas9-NNG，以及基于SlugCas9-NNG的腺嘌呤碱基编辑器，极大地增强了我们在体内进行基因组编辑的能力。
噬菌体辅助进化已被证明是一种高效的技术，已被用于设计SpCas9和Nme2Cas9以满足独特的PAM要求。在这项最新研究中，研究团队开发了一种精细的噬菌体辅助进化策略，以设计一种来自路邓葡萄球菌的紧凑型Cas9核酸酶——SlugCas9.以满足独特的PAM要求。
通常情况下，Cas9工程改造往往会降低，因此，一开始选择一个更高效的Cas9进行噬菌体辅助进化至关重要。SpCas9被认为是活性最高的Cas9核酸酶，研究团队首先比较了SlugCas9和SpCas9的活性，结果显示，SlugCas9的编辑效率与SpCas9相当，因此，研究团队选择了SlugCas9作为噬菌体辅助进化的起点。
使用噬菌体辅助进化，研究团队成功开发出了一种SlugCas9变体——SlugCas9-NNG，相比识别NNGG PAM的SlugCas9.SlugCas9-NNG可以识别更简单的NNG PAM，这大大增强了其基因组编辑的范围和能力。
具体来说，在HEK293T细胞中，SlugCas9-NNG能够编辑所有NNGN PAM靶点，编辑效率因靶点而异，对于NNGA、NNGT、NNGC和NNGG PAM的平均编辑效率分别达到42.9%、31.5%、46.5%和42.5%。相比之下，SlugCas9能够编辑NNGG PAM靶点和一小部分NNGA PAM靶点，但其对NNGG PAM靶点的编辑效率达到了66.3%。
研究团队进一步评估了SlugCas9-NNG的碱基编辑潜力，通过将TadA8e与到SlugCas9-NNG的nickase形式进行融合，生成了一个腺嘌呤碱基编辑器——SlugABE-NNG，并在40个内源位点上与SlugABE进行了比较。结果显示，SlugABE-NNG在NNGN PAM位点上进行了A-to-G碱基转换，而SlugABE仅能有效编辑NNGG PAM位点。此外，SlugABE-NNG还在人诱导多能干细胞(hiPSC)中实现了高效碱基编辑。
接下来，研究天测试了单个AAV载体(AAV-DJ血清型)递送SlugABE-NNG进行基因组编辑的潜力，在人类肝癌细胞系Huh7细胞中测试了SlugABE-NNG编辑PCSK9基因的剪接供体和剪接受体，降低肝脏中PCSK9蛋白的表达可预防和减轻心血管疾病风险。结果显示，单个AAV载体递送SlugABE-NNG实现了对目标位点高达44.4%的A-to-G碱基转换，这些结果突显了SlugABE-NNG用于基因治疗的潜力。
总的来说，该研究应用噬菌体辅助进化，开发出一种紧凑型Cas9核酸酶——SlugCas9-NNG，其能够识别简单的NNG PAM序列，进一步扩大了基因编辑靶向范围。更重要的是，该研究还开发了基于SlugCas9-NNG的腺嘌呤碱基编辑器——SlugABE-NNG，它可以由单个AAV载体进行递送。这项研究也证明了噬菌体辅助进化是一种简单而又稳健的Cas9核酸酶设计策略，预计还可以该策略设计满足其他PAM要求的Cas9核酸酶。
资料来源
1.公众号生物世界
https://mp.weixin.qq.com/s/G-OdyHE6cj3xSosaZDXlPQ