近年来,基因治疗领域发展迅速,无论是基础研究还是产业转化都取得了重大突破。其中AAV是基因治疗最重要的一种递送载体,被广泛应用于各种体内研究,比如,将携带有特定基因序列的AAV注射至动物体内,对目的基因进行基因增强、基因沉默或基因编辑。今天,小派就借近期客户新发表的一篇文献和大家聊一聊AAV基因治疗研究神经疾病的新思路。

随着世界人口老龄化进程的加快,神经退行性疾病正在影响着越来越多的人群。世界卫生组织预测,到2040年,神经退行性疾病将成为人类第二大致死疾病。然而,目前大多数用于神经退行性疾病的药物是对症治疗,未能从根本上解决疾病进展的问题,而基因治疗,特别是针对单基因突变导致的神经退行性疾病,则为实现这一目标带来希望。

近日,暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授,李世华教授,闫森研究员,联合中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员在Nature Biomedical Engineering上发表题为 Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington’s disease 的研究论文 。该研究通过向亨廷顿基因敲入猪模型单次脑立体定向注射或静脉注射AAV-CRSPR/Cas9(派真生物构建)并部分替换mHTT(mutant huntingtin)可以有效减少神经退行性变,缓解神经表型。首次在国际上证明基因治疗能有效的改善神经退行性疾病大动物模型的病理变化以及行为症状。

1.CRISPR/Cas9在大动物大脑中的安全性和有效性评估

亨廷顿疾病(HD)是由单基因突变引起的,因此使用基因治疗抑制突变HTT的表达是治疗HD的有前景的策略之一。CRISPR/Cas9介导的基因编辑是永久性的,可能有效抑制体内mHTT的表达。

 

近年来,猪成为研究神经退行性疾病的一种有效的大动物模型,因为它们的大脑在解剖和生理上与人类更接近。李晓江教授团队与赖良学研究员团队在2018年建立了国际首例基因敲入猪模型来模拟亨廷顿病的典型神经细胞死亡特性与运动功能障碍。尽管AAV9已被广泛用于在大脑中传递转基因,但其在大动物模型中的应用仍有待充分研究。闫森研究员团队利用这个基因敲入猪模型评估了aav9递送CRISPR/ Cas9系统在大动物中的安全性和治疗效果。

 

为了排除病毒感染引起的非特异性毒性。研究人员将AAV-Cas9和AAV-GFP(每头猪1.8 × 1013 vg)立体定向注射3月龄成年猪纹状体(图1a)。结果表明,aav介导的CRISPR/ Cas9表达诱导了轻微的病毒感染免疫反应,类似于AAV-GFP对照。鉴于HD和其他疾病中的神经退行性变会引起比上述免疫反应更严重的表型,因此CRISPR/Cas9靶向突变基因治疗神经退行性疾病利大于弊。

图1. AAV-mini-CMV-spCas9病毒载体示意图

关于猪静脉注射AAV9的有效性和安全性,闫森研究员团队今年1月24日发表的一篇文献有进行详细的描述,感兴趣的老师可在后台回复HD获取文献链接,此外我们也会在后续进行文献解读和大家分享。

2.脑注射或静脉注射CRISPR/Cas9对HD KI猪的治疗效果

为了促进同源重组,研究人员设计了两个gRNAs,以mHTT等位基因中CAG重复为靶点。一个由人类HTT外显子1和20个CAG组成的供体DNA(图2a)。因为纹状体是HD KI猪受影响最严重的大脑区域,且大多在3个月大时开始出现症状,研究人员将AAV CRISPR/Cas9注射到3个月大的HD KI猪的纹状体中。注射AAV CRISPR/Cas9后,通过AAV9-gRNA-RFP载体表达的红色荧光蛋白(RFP)可以看出gRNA在注射的脑区和神经元细胞中广泛表达(图2b,c)。

 

为了检验注射的大脑区域是否发生CAG重复替换,研究人员在注射5个月后从猪大脑纹状体中分离出基因组DNA,并用人HTT序列特异性引物扩增突变等位基因中含有CAG重复的DNA片段,结果表明正常的CAG重复(20CAG)取代了扩增CAG重复(150CAG)。此外,研究人员发现CRISPR/ cas9介导的indel移码突变还可以改变阅读框,终止mHTT蛋白的表达,导致mHTT的表达降低,并能有效治疗HD KI猪模型的病理变化以及运动症状(图2f,g)。

图2. 脑注射AAV9 HTT-gRNA-RFP-20Q/Cas9对HD KI猪的治疗效果

为了检验静脉注射AAV CRISPR/Cas9(非侵入性全身传递)是否也能达到治疗效果,研究人员将AAV CRISPR/Cas9静脉注射到出生后3-7天的HD KI猪耳静脉(图3a)。使用新生猪的基本原理是静脉注射AAV9在血脑屏障完全建立之前很容易进入中枢神经系统。结果发现,RFP在脑和外周组织中广泛表达(图3b),说明静脉注射可以使AAV在猪的全身有效分布。同脑内注射AAV CRISPR/Cas9一样,静脉注射能有效治疗HD KI猪模型的病理变化以及运动症状。值得注意的是,静脉注射AAV CRISPR/Cas9对mHTT毒性的抑制程度可能不如脑注射直接靶向特定脑区,但AAV CRISPR/Cas9的全身分布有利于治疗mHTT的非中枢神经系统毒性。例如,在静脉注射AAV9-HTT-gRNA-20Q/Cas9后,睾丸中的mHTT表达也下降了,这表明CRISPR/Cas9靶向发生在生殖细胞中,这可以防止突变基因传递给下一代。

图3.静脉注射AAV CRISPR/Cas9,RFP在HD KI猪脑和外周组织中广泛表达

该研究通过使用HD大动物模型,证明在大脑或外周静脉中单次注射AAV-CRISPR/Cas9可以有效减少神经退行性变并改善相关症状。亨廷顿疾病模型猪基因治疗的方式也为治疗其他神经退行性疾病提供了理论基础与新的思路。

据悉,暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授,李世华教授,闫森研究员与中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员为本文的共同通讯作者。闫森研究员为本文的第一作者。涂著池研究员,博士生郑潇,林颖琪,李彩娟,李嘉威,助理研究员刘朝明,赵宇等也为本研究做出重要贡献。本研究获国家自然科学基金,科技部国家重点研发计划,广东省科技厅,广东省非人灵长类动物模型研究重点实验室,广州市重点研发计划脑科学重大专项等基金的资助、教育部“中枢神经损伤与修复”创新引智计划等课题资助,并得到暨南大学的大力支持。

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