1、慢病毒感染细胞效率低？
| 可能的原因 | 解决方案 |
| 病毒滴度低，导致感染剂量不足 | 对病毒进行重新定量； |
| 提高病毒滴度：浓缩病毒液，使用更高效的病毒包装系统 | |
| 优化感染复数（MOI）：通过逐步增加MOI值来测试最佳的感染量。 | |
| 目标细胞对慢病毒的敏感性低 | 慢病毒通常在其表面有VSV糖蛋白，并利用它与细胞表面的LDL受体结合。如果目标细胞没有表达大量的LDL受体（如某些物种的干细胞系表面的LDL受体表达水平低），那么无论你使用多高的MOI，都不会获得良好的转导效率。用流式细胞术、免疫荧光等方法确定靶细胞表面LDL受体的表达水平，选择LDL受体表达水平高的靶细胞来进行病毒感染实验 |
| 缺乏感染增强剂（如Polybrene）或其浓度不足 | 添加感染增强剂：如添加Polybrene或DEAE-Dextran，浓度可优化至4-8 μg/mL |
| 培养条件（如温度、pH等）不适合病毒感染 | 将细胞培养环境控制在最佳状态，并保持培养基的新鲜 |
2、加入慢病毒后，细胞死亡率很高，该如何处理？
| 可能的原因 | 解决方案 |
| 病毒量过高，导致细胞负荷过重 | 减少病毒量，降低MOI。在感染后 4 小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。 |
| 感染增强剂浓度过高，具有毒性作用 | 降低感染增强剂浓度，并考虑减少暴露时间。 |
| 转染的基因对细胞有毒性 | 改进基因设计，使用不同的启动子或条件诱导型表达系统，避免毒性基因的持续过表达。 |
| 细胞状态不佳或培养条件不适 | 确保细胞健康，优化细胞生长状态，选择对慢病毒耐受性好的细胞系 |
3、转染后未观察到荧光（带荧光标记）
| 可能的原因 | 解决方案 |
| 病毒滴度低。病毒制备过程中滴度过低，导致感染效率不够，细胞未能有效表达荧光蛋白 | 重新检测病毒滴度：可以通过qPCR或流式细胞等方法测定病毒滴度。 |
| 使用浓缩病毒：通过超速离心或PEG沉淀等方法浓缩病毒，提高感染效率 | |
| 提高感染剂量，增加病毒的MOI | |
| 靶细胞感染效率低 | 增加感染增强剂 |
| 确保靶细胞处于良好状态，生长密度适中（通常70%-80%），细胞过于稀疏或过密都会影响感染效率 | |
| 荧光蛋白未成功表达 | 检查质粒序列，确认荧光蛋白基因的开放阅读框是否正确，是否有其它不利于基因表达的元件（如重复序列、过弱的启动子） |
| 更换启动子：如果使用的启动子对靶细胞不敏感，尝试使用其它更适合靶细胞的启动子（如EF1α、CMV等） | |
| 细胞荧光蛋白的翻译或折叠有问题，某些荧光蛋白在特定的细胞类型中表达时可能无法正确折叠或翻译，从而导致荧光信号弱或没有荧光 | 更换荧光蛋白种类：使用稳定性更好的荧光蛋白，如EGFP、mCherry等，因为有些荧光蛋白在特定细胞内可能会失活或不表达。 |
| 确保细胞在适合的温度和pH下培养，因为这些条件对荧光蛋白的正确折叠和功能很重要。 | |
| 荧光检测设备问题，检测荧光的显微镜或其他设备设置不当，如激发光波长、滤光片、曝光时间等 | 检查显微镜设置：确保激发光波长和滤光片与荧光蛋白的特性匹配。例如，GFP的激发波长为488 nm，发射波长为509 nm。 |
| 增加曝光时间或调整灵敏度：适当延长荧光检测的曝光时间，以捕捉较弱的荧光信号。 | |
| 通过阳性对照验证设备：使用已知表达荧光的阳性对照细胞，确认显微镜或流式细胞仪的设置正常。 | |
| 荧光信号被淬灭。某些培养条件或试剂（如某些培养基、固定液）可能会导致荧光蛋白信号被淬灭 | 检查培养基和试剂：避免使用含有自发荧光的试剂（如某些种类的酚红或固定液），或将培养基换成不含酚红的培养基。 |
| 如果需要固定细胞，使用适合荧光蛋白的固定液，如4%多聚甲醛，避免使用甲醇等会导致荧光淬灭的试剂。 | |
| 时间过早或过晚检测。荧光蛋白的表达需要一定时间，过早检测可能无法看到荧光；另一方面，细胞过度增殖或老化也会影响荧光蛋白的表达或稳定性。 | 优化检测时间：通常，慢病毒感染后24-72小时是荧光蛋白表达的高峰期，建议在此时间段内检测荧光信号。 |
| 延迟检测：如果荧光表达较弱，尝试延长感染后检测的时间，直到荧光信号稳定。 | |
| 病毒基因组未能有效整合到宿主细胞基因组中，或基因组整合后基因被沉默 | 检查整合效率：使用整合型慢病毒系统，确保病毒基因组能够稳定整合到宿主细胞中。 |
| 使用抗沉默元件：有时细胞可能会通过染色质重塑或DNA甲基化机制将外源基因沉默，可以在载体上添加WPRE（木鼠白血病病毒后调控元件）等增强表达的元件。 | |
| 考虑使用筛选标记：如果慢病毒载体中包含抗生素抗性标记，可以通过抗生素筛选阳性细胞，确保荧光蛋白在存活的细胞中得到表达。 |
4、病毒感染后qPCR检测无过表达效果的原因？
| 可能的原因 | 解决方案 |
| 靶细胞目的基因内源表达水平太高，影响了外源基因的表达 | 选择目的基因低表达的细胞系 |
| 检测引物设计问题 | 过表达构建的都是CDS区，所以引物必须设计在CDS区才能检测出外源的过表达 |
5、病毒感染后qPCR检测无敲低效果的原因？
很可能是目的基因的表达水平过低，建议在敲低之前用qPCR检测目的基因的表达水平，选择Ct值<30的目的基因进行下一步的敲低实验。
6、实验重复性差
| 可能的原因 | 解决方案 |
| 病毒的滴度和质量不一致 | 标准化病毒生产：每次实验中确保病毒滴度和质量的稳定性，使用统一的方法和条件生产和浓缩病毒 |
| 细胞状态的波动影响了实验结果 | 标准化细胞培养，保持细胞在同一生长条件下，确保细胞状态一致。 |
| 实验操作不规范，导致数据差异 | 记录并优化操作流程，详细记录每一步骤，优化实验流程以减少误差来源 |
7、病毒感染时怎么选取细胞？
要使用处于对数生长期且细胞状态正常的细胞，这样才能保证细胞在病毒感染后仍能顽强生存。
8、用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？
根据细胞增殖速度调整细胞接种量，保证感染后4天左右细胞刚好增长达到90%-100%的汇合度。对于大部分细胞系，接种密度保持在20-30%；对于原代细胞，接种时提高汇合度到50%-60%。
9、向细胞中加入慢病毒的最佳时间是？
在细胞汇合度20-40%且细胞状态良好时加入慢病毒，感染后4天细胞增长达到90%-100%的汇合度。
10、某细胞株的感染复数（MOI）值是多少？
可以参考细胞株相关文献或使用派真生物提供的说明书进行测定。建议进行预实验摸索合适的MOI值。
11、如何确认最佳感染条件？
使用不同助感试剂和不同的细胞数与病毒颗粒数比例进行感染预试验，感染后选择感染效率在80%左右，感染后细胞状态正常且病毒使用量最小的感染条件作为最佳感染条件。
12、对于细胞需要进行那些检测？
细胞最好有STR分型鉴定并经过支原体污染检测，如果在培养过程中以及发现支原体污染，可以使用支原体去除试剂盒消除细胞中的支原体。
13、慢病毒活性滴度怎么标定最准？
绝对定量！“绝对定量”是医疗级病毒产品的公认滴度检测方法。TU=transducing units，即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。其他的VG/mL，VP/mL指所有病毒颗粒数，有无生物活性均计算在内。
14、细胞培养过程中的常见问题
（1）细胞用慢病毒一感就死或者出现小黑点：细胞老化或者病毒过感染了
（2）培养基快速变黄且浑浊：存在细菌污染
（3）显微镜下就可看到纵横交错穿行的丝状物：真菌污染
（4）细胞生长缓慢：病毒过感染或者支原体污染或者细胞老化
（5）高浓度病毒感染组出现细胞死亡，低浓度组正常：病毒浓度太高对细胞有伤害
（6）任何感染组细胞均死亡：目的基因功能蛋白对细胞生长有杀伤作用
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