怎么检测AAV病毒产品的纯度

检测腺相关病毒（AAV）病毒产品的纯度通常需要结合多种分析方法，以确保去除杂质并保证产品的安全性和有效性。以下是常见的检测方法：

1. SDS-PAGE和银染

目的：分析AAV病毒衣壳蛋白的组成和完整性。

方法：通过SDS-PAGE电泳分离VP1、VP2和VP3蛋白（相对分子量分别约为87、72和62 kDa），然后进行染色。

结果：纯度高的AAV样品应呈现三条清晰的蛋白带。

2. Western Blot

目的：检测AAV衣壳蛋白的特异性和纯度。

方法：使用针对AAV衣壳蛋白的抗体（如抗VP1/VP2/VP3抗体）进行免疫检测。

结果：纯度较高的AAV样品应仅显示VP蛋白条带，无其他杂蛋白。

3. 透射电子显微镜（TEM）

目的：观察AAV病毒颗粒的形态、完整性及空壳与实壳的比例。

方法：通过负染法或冷冻电镜（Cryo-EM）成像，直接观察病毒颗粒。

结果：纯净的AAV样品应呈现均一的颗粒结构，且空壳与实壳的比例可通过统计分析得出。

4. qPCR/ddPCR（定量PCR/数字PCR）

目的：检测AAV样品中基因组拷贝数（vg，viral genome）。

方法：

使用特异性引物检测AAV基因组DNA。

计算vg/mL浓度，与总蛋白或总颗粒数对比，评估基因组包装比例。

结果：纯度高的AAV应表现出较高的vg/titer比值，表明空壳较少。

5. ELISA（酶联免疫吸附测定）

目的：检测AAV衣壳蛋白含量及抗原性。

方法：使用AAV衣壳蛋白特异性抗体，定量检测总AAV颗粒数（gc/mL，genome copies per mL）。

结果：与qPCR数据结合，可以评估空壳比例。

6. 离子交换层析

原理：利用AAV颗粒表面的电荷性质，通过带不同电荷的填料进行吸附和洗脱。

操作：将AAV样品通过离子交换柱，根据洗脱曲线分析纯度。

优点：操作简便，通量较高，适用于大规模生产。

7. 亲和层析

原理：利用AAV衣壳蛋白与特定配体的特异性结合，通过亲和层析柱进行纯化和分析。

操作：将AAV样品通过亲和层析柱，通过洗脱液收集纯化的AAV颗粒。

优点：纯度高，能够有效去除杂质。

8. 内毒素检测

目的：检测AAV样品中的内毒素水平，以确保符合生物制剂安全标准。

方法：使用鲎试验（LAL测试）。

结果：内毒素水平应低于推荐的安全标准（如<5 EU/mL）。

9. 超速离心分析（AUC, Analytical Ultracentrifugation）

目的：检测空壳和实壳AAV比例，评估病毒样品的纯度。

方法：利用AUC分离不同密度的AAV颗粒，计算空壳/实壳比值。

结果：较优质的AAV通常具有较高的实壳比例（如≥70%）。

总结

基本纯度检测：SDS-PAGE、Western Blot、ELISA

基因组完整性：qPCR/ddPCR、琼脂糖凝胶电泳

形态与空壳/实壳比例：TEM、AUC

安全性检测：内毒素检测、宿主DNA残留检测

不同应用场景可能需要选择合适的检测方法组合，以确保AAV病毒产品的质量和纯度符合研究或临床应用标准。