AAV载体进化简史（4）：从理性设计、AI辅助衣壳设计到人体筛选

得益于结构解析技术和生物信息数据库的飞跃式发展，今日的理性设计已更加高效与可控。但在上世纪90年代，科学家对AAV衣壳结构、受体识别机制、免疫原性等方面的认知仍非常有限，使得早期的理性工程充满挑战。

早期AAV理性设计工作的基础，主要建立于：序列同源建模（Homology Modeling），经验性实验验证和以AAV2为核心模型的工程探索。当时，AAV2是唯一拥有成熟生产系统并进入人体临床试验的rAAV血清型，也具备良好的体外转导效率，因此成为AAV工程的“起点”。

1998年，Summerford & Samulski首次确认AAV2的主要细胞受体为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG），这是AAV研究史上的重大突破。此前，在31种真核细小病毒中，唯一已知的病毒受体是人B19细小病毒结合的红细胞P抗原。这项发现不仅揭示了AAV2与靶细胞结合的分子机制，也为后续的理性衣壳改造与定向递送提供了理论支撑。紧接着在1999年，Samulski实验室识别出共受体αVβ5整合素，Srivastava实验室确认了FGFR1（成纤维细胞生长因子受体）。这一系列发现帮助人们初步勾勒出AAV2转导过程的多步骤机制，为精准设计奠定了基础。

1999年，在缺乏高分辨率晶体结构数据的背景下，Girod等人通过与犬细小病毒（CPV）等已解析结构对比，预测了AAV2衣壳上六个表面暴露环区（loops）。他们在其中一个环区插入了L14肽段（RGD基序），实现了向整合素受体的靶向递送，从而成功绕过HSPG依赖路径。这一研究首次证明：AAV衣壳可通过精准插入功能配体实现靶向性重定向；理性突变可赋予AAV在原本难以感染细胞中的转导能力。这项工作成为后续所有理性设计策略的奠基之作，并为肌肉、神经等组织的特异性基因治疗提供了技术原型。

在2000年，Muzyczka团队开展了AAV2衣壳的大规模位点定向突变研究，在59个位置共构建了93种突变体，系统性探索衣壳结构域在组织嗜性、免疫原性、细胞进入与基因组包装中的功能。其中最关键的突变之一是：将AAV2中585-RGNR/AQAA-588位点中的保守基序突变为丙氨酸（Ala），这是AAV2与HSPG结合的关键区域，直接影响其天然靶向性。此研究首次从结构层面构建了衣壳功能图谱（structure-function map），为后续AAV2定向组织递送的理性改造奠定了基础。

同年，Wobus等人通过单克隆抗体（MAb）定位了AAV2衣壳上的关键抗原位点，进一步确认了免疫识别与细胞附着区域，为免疫逃逸型AAV设计提供了靶点，特别适用于重复给药或长期疗效维持的临床需求。

回顾病毒结构生物学的发展：1953年，Franklin和Gosling拍摄的“照片51”首次证实了DNA的双螺旋结构；1958年，Kendrew首次解析了肌红蛋白的X射线晶体结构；1991年，Tsao等人解析了犬细小病毒（CPV）的三维结构，为AAV结构预测提供了模板；2002年，Xie等人首次公布了AAV2衣壳的高分辨率晶体结构，为后续的理性设计、配体插入与结构建模打开大门。然而，作者也指出：AAV结构的复杂性远超“晶体图片”所能展现的那样，它包含了众多难以预测的动态生物物理现象与多层分子调控机制。

尽管我们已对AAV衣壳的功能域与受体互作有了系统理解，但直到2007年，Srivastava团队首次揭示：AAV2衣壳可被EGFR蛋白酪氨酸激酶磷酸化，磷酸化后触发泛素化（ubiquitination），进而导致胞内运输效率下降，入核受限，转导效率降低。于是，在2008年，研究团队将表面暴露的酪氨酸位点（Y）通过定向突变替换为苯丙氨酸（F），避免其被修饰。代表性成果是AAV2(Y444F、Y500F、Y730F)三位点突变体，在动物实验中显著提升了转导效率，并已进入I/II期临床试验，验证了靶向翻译后修饰的衣壳工程在基因治疗中的临床价值。

AAV衣壳蛋白的翻译后修饰（Post-Translational Modifications，PTMs），不仅发生于体内转导过程，也可能在生产与储存阶段就已发生。研究发现，某些PTMs会显著影响AAV的转导效率，受体结合能力，粒子稳定性和免疫识别，影响因素包括但不限于：表达体系（如HEK293、Sf9等宿主细胞）、纯化方法（亲和、密度梯度等）、储存缓冲液与温度等条件。因此，在制造过程中深入理解并控制PTMs，已成为确保AAV产品质量一致性、临床有效性与可重复性的关键一步。

“大自然并不会在GMP洁净室中生产AAV”。在野生型感染中，AAV的产生通常伴随着腺病毒诱导的细胞裂解过程，其释放出的AAV粒子常附带：宿主细胞蛋白，辅助病毒蛋白，这些蛋白可能残留于AAV粒子的内外表面，并深度参与AAV的体内行为，如：生物分布、细胞识别、免疫系统响应等。

虽然当前生产趋势追求超高纯度载体，但一些研究团队却试图 “模拟自然环境”，通过在AAV配方中加入特定结合或屏蔽蛋白，增强其组织特异性、免疫逃逸能力和体内稳定性。例如，已有研究显示AAV会与血清蛋白发生结合，这提示我们：AAV在不同组织液（如玻璃体液、脑脊液、血清）中可能与可溶性蛋白形成不同“蛋白壳层”，这些蛋白可能承担运输（shuttle）与屏蔽（shielding）的角色；AAV的给药途径及其所处微环境可能比我们当前认知的更为复杂多变。

衣壳与蛋白之间的互作不仅由序列决定，还与电荷分布、pH变化、磷酸化等修饰状态紧密相关。蛋白之间的静电力学相互作用会影响其热力学与动力学行为，进而改变AAV的受体结合力与体内行为模式。例如：AAV2的HSPG结合位点正是通过表面静电势计算预测并实验验证的，这也激发了后续团队系统分析不同血清型的表面电荷图谱，为理性设计新型AAV衣壳提供依据（图1A）。

图1 AAV电荷密度分布图。

(A)衣壳电势图。对各血清型衣壳的溶剂可及表面按电势值上色，色阶为红‑白‑蓝渐变，对应 −4 kT/e 到 4 kT/e（约 −100 mV 至 +100 mV，25 °C）。依次展示：以五重对称轴为中心的完整衣壳、以三重对称轴为中心的衣壳以及衣壳内表面。为便于观察，在三重对称轴示意图中，未聚焦的衣壳表面以半透明灰色显示。(B)VP3结构对比。将AAV2（绿色）、AAV4（品红色）、AAV5（青色）和AAV9（橙色）的VP3结构域叠合，均以蛋白主链丝带形式呈现，直观展示它们的构象差异。

AAV 各血清型在维系衣壳稳定性和结构完整性所需的关键区域上高度保守，同时又在决定表型多样性与受体特异性的可变区呈现显著差异。随着分子生物学技术和 DNA 测序手段的飞速发展，天然 AAV 血清型及其变体的“谱系”不断扩充，为载体工程提供了更加丰富的素材库。伴随着数据量的激增，基于同源性的去卷积策略（homology‑based deconvolution）已成为 AAV 理性设计的核心方法之一，可在不同血清型间实现“知识迁移”，预测并构建具有更高治疗潜力的新型衣壳（图 1B）。

2010年，Samulski团队通过位点定向突变技术，改造了AAV2衣壳中位于VR-VIII环区的六肽序列（585-RGNRQA-590），将其替换为其他血清型及非人灵长类来源的对应氨基酸，从而构建出一系列AAV2内环突变体（AAV2i系列）。其中，AAV2i8（AAV2与AAV8的嵌合体）展现出显著的组织靶向性改变：从肝脏递送成功“重定向”至骨骼肌递送，同时对人抗AAV2血清的中和抵抗能力增强，提示其具备更好的免疫逃逸性能。目前，AAV2i8已进入II期临床试验，成为理性设计改进组织靶向性+免疫逃逸双重突破的典型示范。

2012年，AAV2.5成为首个通过结构设计进入临床的嵌合型AAV载体，用于杜氏肌营养不良（DMD）治疗的随机双盲临床试验。该载体融合了AAV1的肌肉递送能力，AAV2的工程平台优势与表达稳定性，并整合了抗原表位修饰以获得抵抗中和抗体的能力。AAV2.5在临床试验中被证实安全、耐受性良好，为后续设计如AAV2G9、AAV2i8G9等嵌合载体打下基础，推动了结构驱动的AAV设计全面走向特定疾病靶向递送与免疫应答规避的时代。

2015年，Luk H. Vandenberghe 团队开创性地引入祖先序列重建（Ancestral Sequence Reconstruction, ASR）方法，预测出一组具有进化代表性的AAV祖先衣壳序列，构建了包含9个“进化节点”的候选序列群。最终，研究团队从中筛选出性能最优的Anc80L65，其具有以下显著特点：被预测为AAV1-3与AAV7-9的共同祖先序列；在肝脏、肌肉、视网膜等组织中均展现出极高的体内转导效率；可作为无天然血清来源的“合成型血清型”，规避人群中常见抗体中和风险。Anc80L65的成功，标志着AAV理性设计由结构域突变和嵌合融合，进化至基于系统进化理论的前沿策略。