技术干货 | AAV实验“避坑”指南

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)作为一种安全高效的基因递送载体，深受广大科研人员偏爱，常被用于体内基因敲低、基因过表达、基因编辑、动物的模型的构建和基因治疗。然而，AAV的应用涉及众多关键因素，稍有疏忽便可能引发各种问题，影响实验的顺利进行。因此，我们特别整理了使用AAV时容易踩到的“坑”，希望大家在实验中能够提前规避，从而获得理想的实验结果。

一、”一剂量定结论“

常犯的错误：在使用AAV进行实验时，很多研究者常常直接套用文献中的注射剂量。部分研究者为了赶进度，更是直接照搬文献中的参数。这种做法虽然看似保险，实则暗藏隐患。因为不同实验室的AAV滴度定量方法、实验操作细节以及实验动物的遗传背景等因素存在差异，这使得AAV的注射剂量并不能简单地一概而论。

正确的做法：在正式实验之前设置浓度梯度进行预实验，确定最合适的AAV使用剂量。

举例：为了评估AAV介导的光遗传学工具在RGCs中的剂量依赖性表达及其对视觉功能恢复的影响，通过给三重敲除（TKO）盲鼠模型（Opn4−/−Gnat1−/−Cnga3−/−）的玻璃体注射不同剂量的病毒载体（1.5×10⁷至1.5×10¹⁰vg/眼），确定了最佳病毒剂量范围（约10⁸ vg/眼，图1）[1]。

图1 转导效率的病毒剂量依赖关系

体外实验梯度设计方案(供参考)：

小鼠体内实验梯度设计方案（供参考）：

注意：成年小鼠体重约20-25克

操作建议

• 首次实验使用3-5个剂量梯度，确定大致剂量区间。
• 第二轮实验聚焦最佳区间，使用较小间隔（2-3倍）的3-4个剂量点。

 二、 对照组缺失或设置不当

常犯的错误：在使用AAV进行实验时，为了节省成本，只设实验组，没有阴性对照和阳性对照组；或者对照组设置不当。

正确的做法：除了实验组以外，根据实验需要，设置阴性对照组和阳性对照组。

(1) 阴性对照组

• 未处理对照：不做任何处理的样本，用于确定基线水平和系统背景。
• 假手术对照：注射PBS或生理盐水，模拟注射操作的物理过程，确保实验组和对照组在操作条件上尽可能一致。
• 空载体对照：含相同血清型但不含目的基因表达盒的AAV载体，用于评估空壳体介导的细胞内信号和免疫反应是否会影响表型。

注意：空载体≠PBS/生理盐水，两者结果常有显著差异

(2) 阳性对照组（以下至少选一）

• 标准报告基因载体：相同血清型的AAV-GFP或AAV-luciferase，用于验证AAV载体系统的感染性。
• 已知有效的治疗载体：已发表研究中证实有效的AAV制剂，用于提供有效性的参考基准。

举例：为了研究纹状体中两轮AAV注射导致的星形胶质细胞向神经元转化的效果，作者设置了同血清型GFP对照组，以验证AAV载体系统的感染效率；同时设置了假手术（Sham）组，以排除注射操作本身对实验结果的潜在影响（图2）[11]。

图2 纹状体中两轮AAV介导的星形胶质细胞向神经元转化[11]。

三、常见AAV感染低效问题及解决方案

成功的AAV实验需要系统化的设计、精确的执行和科学的分析。本文强调剂量梯度和对照组设计的重要性，希望能帮助研究者避开常见陷阱，获得可靠、可重现的实验结果。