1. AAV包装需要哪些基本组分？
AAV包装通常依赖“三质粒系统”：
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载体质粒（Transfer plasmid）：包含 ITR 序列与目的基因表达框。
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辅助质粒（Helper plasmid）：提供腺病毒必要辅助基因（如 E2A、E4、VA）。
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衣壳质粒（Capsid plasmid）：决定 AAV 血清型（如 AAV2、AAV8、AAV9、PHP.eB 等）。
有的系统为二质粒或四质粒体系，均属于同类原理。
2. AAV包装常用的细胞系是什么？必须用HEK293T吗？
最常用的是 HEK293T 或 HEK293。
原因：它们天然表达腺病毒 E1 基因，可提供部分辅助功能，利于AAV高效包装。
3. AAV包装流程是怎样的？
典型步骤：
① HEK293T细胞铺板、达到70–90%密度 →
② 三质粒共转染 →
③ 48–72 h收集细胞（有的每24 h收一次上清） →
④ 细胞裂解（Freeze-thaw 或 Benzonase处理） →
⑤ 纯化（梯度离心、柱纯化等） →
⑥ 滴度测定（qPCR、ddPCR）。
4. AAV可以包装的基因大小限制？
AAV原生包装能力约 4.7 kb，含上下游元件常建议 <4.4 kb。
超过容量会严重降低滴度与转导效率。
可用 双AAV系统（Dual-AAV） 解决大基因问题：Overlap、Trans-Splicing 等策略。
5. 为什么我的AAV滴度很低？
常见原因包括：
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载体质粒中存在 ITR结构损伤。
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细胞状态不好（过密/过稀）。
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转染效率低。
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操作中未加Benzonase导致游离DNA干扰。
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目的基因表达毒性。
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血清型本身滴度偏低（如某些工程衣壳）。
6. AAV包装后纯化方式如何选择？
常见方法与特点：
| 纯化方法 | 优点 | 缺点 |
| CsCl梯度 | 高纯度 | 操作复杂、时间长 |
| Iodixanol梯度 | 纯度高、损伤小 | 不适合大规模制备 |
| Affinity column（AVB、Capto） | 快、高通量、规模化 | 可能富集空壳 |
| PEG沉淀 | 快速、廉价 | 纯度低、蛋白污染多 |
7. 如何判断AAV是否有空壳、满壳？
常用评估方法：
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AUC（分析超速离心）
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TEM（透射电镜）
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Dot blot + Protein blot 比值
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qPCR / ELISA 计算 vg:vp 比例
空壳比例高会影响感染效率，但对安全性无明显问题。
8. AAV存储条件是什么？能冻融吗？
推荐：
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-80°C 长期保存；
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避免反复 冻融；
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使用 含0.001–0.05% Pluronic F68 或 0.1% BSA 的体积保护剂防止吸附损失。
AAV在 -80°C 稳定性最好，在 4°C 下会随时间轻微降解，短期放置（1–2周）一般可以。
9. AAV的滴度是如何定义的？vg/mL 是什么意思？
vg/mL（vector genomes per mL） 表示每毫升溶液中的“病毒基因组数量”，通常由 qPCR 或 ddPCR 测量。
注意：
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vg ≠ 传染单位
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AAV是非复制病毒，因此 TU/mL 难以准确评估。
10. AAV感染效率低可能原因？
常见因素：
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细胞类型耐受性差
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血清型选择不匹配
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目的基因毒性
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滴度不足或空壳比例高
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细胞状态不好（贴壁不牢、分裂迅速等）
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感染时添加血清或无辅助物质（如 Polybrene 对AAV无效）
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