小鼠脑内 AAV 立体定位注射实验方案

适用组织器官：全脑或部分脑区

1.实验前准备：

小鼠、病毒储存液(冰上解冻)、立体定位仪(带鼠适配器)、微量注射泵及控制器(例如Harvard Apparatus或KD Scientific)注射器和微量进样针(Hamilton系列，通常10μL容量，33G针头)、精细剪刀(直尖和弯尖)、尖头和钝头镊子、手术刀柄和刀片(#10或#15)、棉签和纱布、手持式颅骨钻、加热垫或恒温水循环毯(维持动物体温)、小鼠固定架(耳棒和牙棒)、无菌手术垫、照明光源、剃毛器或剃须刀(手术区域剃毛用)、无菌棉签和纱布垫、异氟烷(Isoflurane)和蒸发器系统（或者1%的戊巴比妥，用于麻醉小鼠）、无菌生理盐水(0.9% NaCl)、75%乙醇(皮肤消毒)、双氧水、碘伏(手术区域消毒)、无菌PBS(病毒稀释用)、金霉素眼膏(防止麻醉期间眼睛干燥)、皮下注射用镇痛药(如美洛昔康，1-2mg/kg)、抗生素软膏(手术部位涂抹)、无菌手术手套、口罩和帽子、微量离心管(用于病毒稀释)、缝合材料(如5-0或6-0无创伤性缝线)或皮肤胶

2.小鼠麻醉

确认手术室的通风系统已开启，以保证空气流通。用含 4% 异氟烷的诱导箱麻醉小鼠。或是小鼠称重后腹腔注射1%戊巴比妥，剂量为80mg/kg体重），放置于饲养笼内，约5-10min。

3.小鼠固定

a.麻醉后，剃除小鼠头部毛发。

b.用镊子将小鼠舌头拨向一侧并下压，将其固定于立体定位仪：先将咬棒放入口中，使门齿落入槽内，再插入耳棒固定。确保小鼠身体置于加热垫上，鼻子放入鼻罩，诱导时使用 3–4% 异氟烷；固定后通过鼻罩维持 1–2.5% 异氟烷，根据麻醉深度调整。用镊子夹捏后肢确认麻醉深度，确保无缩足反射。

c.滴人工泪液润滑双眼。用75%乙醇和碘伏交替擦拭手术区域3次进行消毒，完成注射部位准备。

4.暴露头骨及水平校准

a.用眼科剪沿颅顶正中剪开头部皮肤（长约1.5cm)。

b.用钝头镊子轻轻分离皮肤，露出颅骨。用棉签蘸取双氧水擦拭颅骨，使其干燥并便于识别前囟（bregma）。

c.调整前囟和后囟在同一水平位置，并调整左右两侧平行，将微量注射器针头置于前囟点位置后坐标归零。

5.病毒注射

a.根据注射脑区位置的横纵坐标找到颅骨表面下针点并标记，将异氟烷降至 2%。使用微型颅钻在目标坐标处缓慢钻孔，避免过度下压；钻透前减小压力，必要时用细针轻轻移除薄骨片，避免损伤硬脑膜和脑组织。一定要防止扎到脑组织，如果此过程出血，可用小的医用棉球拉成长条形将血吸走。

b.用PBS冲洗微量注射器3-5次（每次吸取5 µL）。

c.可保留微小空气柱用于区分液体界面和确认推进情况，但不得将空气注入脑组织；注射前应排除针尖气泡并确认针头通畅。

d.将微量注射器固定在脑立体定位仪上，并与微量注射泵相联。将微量注射器针头经颅骨钻孔处垂直插入脑内目标位置，启动微量注射泵以 0.2 µL/min 的速率开始注射。一般从最深层 z 坐标开始注射。例如齿状回注射深度依次为 –2.5、–2.4、–2.3 mm。在最深点注射完毕后静置 1 min，再升至下一坐标继续注射，直至完成所有深度。最后一次注射结束后静置 5 min，再缓慢拔针。

注：在小鼠单侧半球注射总量不超过 2 µL 病毒时，未见组织不良反应。

6.动物复苏

a.注射结束后，将小鼠移出立体定位仪，用 6-0 丝线缝合头皮。用碘伏对创口及其附近进行消毒，并涂抹抗菌软膏。

b.经腹腔（I.P.）注射 0.8–1.0 ml 生理盐水 + 酮洛芬（3–5 mg/kg）镇痛。随后将小鼠放入恒温恢复箱。待其完全清醒并能保持胸骨俯卧位前，不得离人；待其完全恢复前，不得与同伴合笼。

图片来源：https://app.jove.com/v/23740/stereotaxic-viral-injection-for-targeted-neuronal-gene-editing-mouse

7.常见问题及解决方案