小鼠鞘内病毒注射实验操作流程

适合组织器官：中枢神经系统(CNS)

1.实验前准备

小鼠、病毒储存液(冰浴融化)、25 μL 或 10–25 μL Hamilton微量注射器或胰岛素注射器（1mL)、异氟烷(Isoflurane)及蒸发器系统、小动物加热垫(术后恢复用)、无菌手术铺巾、无菌手套、口罩、手术帽和实验服、盐酸利多卡因(便于鞘内扩散)、无菌PBS(用于病毒稀释)、碘伏、70%酒精(皮肤消毒用)、一次性无菌棉签、体重计(剂量计算用)、软布/毛巾(用于固定小鼠)

a.20% 盐酸利多卡因储备液的配制：称取 2 g 盐酸利多卡因，加入 5–6 mL 无菌水，轻轻涡旋混匀后用无菌水定容至 10 mL。用 0.2 μm 滤膜过滤储备液。将滤液按每管 1 mL 分装至 1.5 mL 离心管，并用封口膜密封，4 °C 保存。

b.病毒稀释与剂量计算：

剂量范围: 鞘内注射AAV通常使用1×10^10 – 5×10^11 vg/只小鼠。

注射体积: 成年小鼠(8周以上): 5-10μL是最佳体积；新生/幼年小鼠: 2-5μL。

稀释准备：使用无菌PBS将AAV稀释至所需浓度。例如：制备 AAVrh.10 / 1% 盐酸利多卡因复合液：取 95 μL rAAVrh10 原液（5 × 10^12 vg/mL）加入无菌 200 μL 离心管，再加入 5 μL 20% 盐酸利多卡因储备液，上下吹吸混匀，冰上 4 °C 保存。

注：每只小鼠用量为 8 μL。

c.注射器装载 AAV 溶液：将 25 μL Hamilton 注射器与 27 G 针头组装，使针头斜面与注射器刻度线对齐。轻轻吸取 8 μL 病毒稀释液，排除气泡，置于冰上备用。

d.用 70% 乙醇浸湿的灭菌纱布擦拭操作台。

e.麻醉：将小鼠用异氟烷吸入麻醉(诱导4-5%，维持1-2%)，俯卧位放置于操作台面。

f.用拇指和食指/中指分别固定小鼠骨盆两侧，绷紧双侧髂骨间皮肤；同时用掌心轻压小鼠上半身。剃除髂骨间背部被毛，用碘伏及 70% 乙醇消毒皮肤。

2.病毒注射

a.用另一手拇指或食指沿中线触摸髂骨间椎间隙，并以指甲在 L5–L6 椎间隙压出凹陷，标记进针点。轻轻旋转尾根部，确认脊柱正中线；进针前将针头斜面朝向鼠头端。

b.确保小鼠固定牢固，将针头沿脊柱中线垂直（或 70–80°）刺入凹陷处，保持矢状面居中。触及骨质后，缓慢将角度减小至约 30°，滑入椎间隙。

注：成功进入硬膜内空间时，鼠尾会出现明显甩动；此时针头会被“夹紧”。27 G 针头适用于小鼠，但不适用于大鼠。

c.启动计时器，以 1 μL/4 s 的速度注入 8 μL 病毒溶液。

d.注射完毕后留针约 1 min，轻柔旋转并退出针头，防止渗漏。

3.动物复苏

将小鼠置于铺有柔软垫料的恢复笼中，温度保持在37°C。监测呼吸、体温和意识恢复情况。确保小鼠能够正常饮水和进食。

图片来源：https://app.jove.com/v/31924/intrathecal-delivery-viruses-mouse-model-for-treating-central-nervous

4.常见问题及解决方案