Zolgensma（onasemnogene abeparvovec-xioi）是由AveXis, Inc开发的一款SMN1基因替代疗法药物，诺华在2018年4月7日用87亿美元收购AveXis, Inc., 获得该突破性AAV基因疗法。2018年12月4日，诺华向FDA递交了Zolgensma生物制剂的许可申请，并获得FDA优先审评资格。随后美国FDA于5月24日首次批准Zolgensma用于治疗2岁以下脊髓性肌萎缩症SMA。
为了让更多成熟稳定优质的生产工艺应用到药物生产中，笔者对FDA关于Zolgensma相关的CMC材料进行了收集整理，根据已披露的信息进行了简单的分析，以供相关人员参考和借鉴。
通过FDA评审小组得出的结论，认为Zolgensma的生产工艺能够生产出具有一致质量特性的产品，因此CMC评审小组建议批准。由此可以看出，FDA对药物生产工艺的质量稳定性有着一定的要求，那么对于Zolgensma来说，具体是指哪些内容呢？
Zolgensma是一种基于腺相关病毒(AAV)载体的静脉输注基因治疗悬浮液。活性成分是一种重组自互补载体，其中双链DNA载体基因组被包裹在由AAV衣壳蛋白组成的衣壳中。载体由巨细胞病毒增强子/鸡-β-肌动蛋白启动子的杂合启动子启动，包含一个编码人类运动神经元(SMN)蛋白的转基因。
在病毒载体制备的方法及用途上，AveXis公司申请了相应专利，提供了制备和纯化病毒颗粒的方法，以及包含病毒颗粒的组合物和用途。Zolgensma药物组合物，如下表所示：
| 药物组合成分 | 数量 | 备注 |
|---|---|---|
| AAV9 | 1~8E13vg/ml | |
|
空病毒衣壳 |
约＜7% |
|
| 宿主细胞蛋白 |
约＜100ng/ml |
1E13vg/ml病毒浓度 |
| 宿主细胞DNA |
约＜5E6pg/ml |
1E13vg/ml病毒浓度 |
该方法被AveXis公司用于zolgensma（批号AAV9SMN0613）的制备工艺，同时与国立儿童医院NCH的制造工艺进行了对比，如下图所示，
（1）NCH阶段1批次AAVOSMN0G13的生产先于目前通过ddPCR测量的基因组效价的“建议的测试限”。使用政进的SOP-137(v3） 在2017年8月重新建立了该批次的基因组效价值。
（2）工艺A和工艺B批次之间基因组效价结果的差异是由于制造目标浓度不同所致。最初将批次NCH AAV9SMN0613配制为较低的目标效价浓度，现在通过当前使用的ddPCR测定法(SOP-I37）将其确定为1.1E13vg/mL,而AVxS-101批次600156和600307的配制目标效价度浓度通过相同方法 (SOP-137）进行测量时为4E13vg/mL。
（3）调整每1E13vg/mL的结果，以实现从2E13vg/mL至613 ve/mL的可接受浓度范围内的适当规格。实际值已乘以以下因子以提供每1E13vg/mL的值：1/1.06（批次NCH AAV9SMN0613)，1/3.7（批次600156)和1/4.0（批次 600307)。
（4）工艺A和工艺B之间的外观结果差异是由于不同的载体浓度（基因组效价）引起的。批次NCH AAV9SMN0613的载体浓度明显低于工艺B批次。结果，批次NCH AAV9SMN0613更稀，从而导致更澄清和无色的溶液，而工艺B批次的无色至白色且稍不透明的观察结果是因为每mL溶液中病毒颗粒浓度接近4倍。
（5）实际结果未调整为1E13vg/mL，因为结果低于相应方法的LOQ。
（6）批次NCHAAV9SMN0613被指定 为SOP-285的初始效力参考标准，分配的效力值为100%。所有结果均使用SOP-285 v5生成。
从测试结果可以看出，工艺A和工艺B之间存在差异，与使用碘克沙醇的工艺A相比，使用CsCl梯度的工艺B在去除空衣壳方面更有效。
Zolgensma药品的标准浓度为2E13vg/mL。每瓶10ml的药品含有不小于5.5 mL或8.3 mL的可提取体积，辅料为20mm tris (pH 8.0)，1mm氯化镁(MgCl2)，200mm氯化钠(NaCl)和0.005% 泊洛沙姆188。本药品是无菌灌装，不含防腐剂。二次包装是冷冻运输，收到后应在冰箱中保存不超过14天。
在检测中，会测试药品的一般性质，包括外观，pH值，渗透压和AAV衣壳蛋白的分子量。
该药品由无菌过滤分装，药品灌装工艺不引入任何与工艺相关的杂质，也不包括任何进一步去除杂质的生产步骤。药品以无菌方式装入小瓶并冷冻。从最终容器中取样的药品需要进行微生物污染物、鉴定、纯度、基因组浓度和效力的测试。
药品批次的活性和效力需通过几种分析来控制，包括定量分析，测量药品在细胞中产生SMN蛋白的能力;半定量实验用来测量静脉注射药物延长脊髓性肌萎缩症转基因小鼠存活的能力。
Zolgensma在冷藏温度下稳定性为14天，室温下在注射器中稳定性为8小时，该药品对光线不敏感。在BLA（Biologic License Application）提交时，药品稳定性没有足够的时间来支持药品在≤-60°C的长期冷冻储存温度下的稳定性。在审评后期，申报人提交了大量在长期冷冻储存温度下储存长达1年的药品的实时稳定性数据。这些数据表明Zolgensma的强度、活性和效力随时间而下降。当在长期储存温度下冷冻保存时，载体基因组浓度在第一年以一定的速度下降，随后几年的下降速度有很大的不确定性。因此，在长期冷冻温度下储存的DP的保质期将被限制在12个月。
完成的I期临床试验(NCT02122952)使用单批次Zolgensma药物产品进行，给药于两组受试者。该 I 期研究最初报告的给药剂量为6.7E13vg/kg和2E14vg/kg，但最初用于确定该初始药品批次浓度的测定方法不准确。在这批初始药品生产44个月后，根据准确和精确的测定方法对载体基因组浓度进行了修订。根据修订后的初始药品批次的浓度，回顾性地将I期研究中的剂量修改为3.7E13vg/kg和1.1E14vg/kg。
在评审后期提交的稳定性数据表明，Zolgensma在长期冷冻储存期间是不稳定的。由于不确定初始药品批次的衰减率，FDA无法确定在I期试验中给受试者的剂量。该机构估计，I期试验1组的剂量范围可能在4.3E13至4.6E13vg/kg之间，2组的剂量范围可能在1.1E14至1.4E14vg/kg之间，存在相当大的不确定性。
在所有正在进行的含Zolgensma的临床试验中使用了新生产的批次药品，并使用准确和精确的测定方法确定了这些批次的载体基因组浓度。正在进行的临床试验中使用的1.1E14vg/kg剂量是准确的。
然而在使用初始临床批次进行第一阶段临床试验后，生产工艺发生了很大变化。当前工艺生产的药品具有与初始临床批相当的关键质量属性。尽管在储存过程中，药品浓度会随着时间的推移而下降，但当直接将当前生产工艺中的批次与最初的临床批次进行比较时，效力与载体基因组的比率是相当的，包括在SMA小鼠模型中提高生存率的能力，采用现行生产工艺生产的药品纯度较高。
AVXS-101药品质量目标 （部分未披露的未展示）：
| 产品QTPP项目 | 产品QTPP项目目标 | 参考依据 |
|---|---|---|
| 适应症及用法 | AVXS-101是一种基于腺相关病毒(AAV)载体的基因疗法，用于治疗小儿脊髓性肌萎缩症(SMA) |
AVXS-101的说明书 |
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给药途径 |
AVXS-101 (IV)作为缓慢静脉输注约60分钟 |
AVXS-101在临床研究中的给药途径 |
| 浓度 |
AVXS-101静脉给药制剂的配制目标浓度为2E13vg /mL |
基于药物开发和预期剂量的目标浓度 |
| 剂型及用量 |
儿科患者静脉输注。体重在8.5kg以下的儿童患者静脉滴注AVXS-101的推荐剂量为1.1E14vg/kg |
易于给药，产品在给药和运输过程中的稳定性，与所需产品功效的兼容性，以及满足推荐剂量所需的体积 |
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剂量强度 |
计划静脉注射剂量强度为2E13vg /ml |
根据临床试验数据推荐剂量 |
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包材系统 |
环烯烃聚合物10mL小瓶。小瓶用20毫米氯丁基橡胶血清塞塞硅胶涂层，小瓶最后用铝密封和塑料翻转盖密封 |
建议使用常用的容器封闭组件进行存储，首选非玻璃材质，避免破裂，确保低温下密封的完整性 |
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交付系统 |
AVXS-101的兼容性已经用以下材料进行了评估和确认: |
基于临床试验研究设计的推荐给药系统 |
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稳定性 |
AVXS-101 (IV)在不同储存温度下的有效期指标如下: |
结果来自长期和加速稳定性数据，以及使用中的稳定性研究 |
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存储处理 |
AVXS-101冷冻运输(≤-60°C[-76°F])，收到后，AVXS-101应立即冷藏在2至8°C(36°- 46°F)，并在几天内使用，含产品的注射器应由药剂师送到手术室，并在8小时内给病人使用 |
稳定性研究和临床试验研究设计的结果 |
一般认为pH、盐浓度和表面活性剂可能是影响AAV载体稳定性的关键因素，但pH对AAV9稳定性的影响尚不明确。AveXis的研究(在优化他们的实验时)表明，表面活性剂的存在对于防止AAV9进入包材和其他表面材料至关重要。AVXS-101药品(DP)生产中使用的所有赋形剂均符合药典级，参见下表：
| 辅料质量和验证试验 | ||
|---|---|---|
| 赋形剂 | 质量标准 | |
| Sodium Chloride 氯化钠 | 未公开 | 外观、标识、内毒素 |
| Tromethamine 缓血酸胺 | 未公开 | 外观、标识、内毒素 |
| Magnesium Chloride 氯化镁 | 未公开 | 外观、标识、内毒素 |
| Poloxamer188 泊洛沙姆188 | 未公开 | 外观、标识 |
| 未公开1 | 未公开 | 外观、标识 |
| 未公开2 | 未公开 | 外观，电导率，内毒素，硝酸盐，总有机碳 |
DP在2-8℃下的稳定性研究在为期6个月的研究中测量了冷藏DP的载体基因组浓度，随着时间的推移没有明显变化。在2-8°C下的稳定性与相同批次在≤-60°C下储存时vg浓度的下降趋势进行了对比，由于图片未能公开，暂未能提供详细数据 。
DP在室温下的稳定性研究对批次的稳定性进行了3个月的评估，随后的批次仅进行了一个月的评估。下降的速率不确定性非常高。效力在一个月内呈大幅下降，并显示出不同的结果。在杂质分析中，杂质(降解的衣壳蛋白)的数量会随着储存时间的推移而增加。
以上对Zolgensma药物CMC程序的简单梳理，对于文件中未展示的数据本文未列出，仅提供公开显示的资料作为工艺开发研究者们参考。
参考资料：
1.CBER CMC BLA Review Memorandum-BLA STN 125694-onasemnogene abeparvovec-xioi-ZOLGENSMA
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