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AAV 常见问题

1、什么是AAV?

腺相关病毒(AAV)是一种单链DNA病毒,目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病。它由蛋白衣壳(capside)和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。蛋白衣壳由三个亚基组成,分别为VP1,VP2,和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列(inverted terminal repeat, ITR)。这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。

作为基因疗法载体的重组腺相关病毒(rAAV)携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同,然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除,取而代之的是治疗性转基因(transgene)。AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs,它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是:一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量,另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。

rAAV在感染细胞后会头尾相连形成环状,能长期存在而不被细胞系统当作外源DNA降解,因此可以在哺乳动物器官或组织中长期保留,并且只有极低的整合基因组机率。这个特性使AAV成为基因治疗的首选载体,也同样成为科学研究中在动物体内传递外源基因的一个优异载体。

AAV作为新一代基因治疗载体,还有一个很重要的特性在于其特异性强。得益于AAV的不同血清型,每种血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力,配合以合适的注射方法,会取得更好的效果。如果您做动物实验,建议首选AAV。

2、rAAV作为基因传递载体,包装外源序列的上限是多少?

rAAV的基因组包装上限约为5Kb,除去两端ITR序列各145bp,则能容纳4.5Kb的外源序列;即:启动子+外源基因+终止信号的总长度不能超过4.5kb;派真的K104载体提供了目前最小的广谱启动子miniCMV(CMV的核心区域,180 bp)及终止子(50 bp)表达盒,可表达约4.4Kb长度的基因,已是能包装基因长度的极限。

3、scAAV和ssAAV的区别

双链AAV(scAAV)感染后2~3天表达水平可到达峰值,单链AAV(ssAAV)感染后表达到达峰值的时间需要约7天;因为单链AAV进入细胞后必须变成双链DNA才能转录和翻译外源基因,这个过程非常缓慢;双链AAV(scAAV)感染效率比单链AAV(ssAAV)有6-15倍的提高;相同的滴度,双链AAV(scAAV)的生产规模需要比单链AAV(ssAAV)的生产规模大,所以双链AAV的包装价格更贵一些。

4、rAAV滴度单位GC/ml代表什么?如何检测?

GC代表genomic copies,基因拷贝数;GC/ml表示每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数;派真生物采用SYBRgreen 荧光定量PCR检测AAV的滴度,同时用ATCC标准品校正;特异性PCR引物是针对ITR区;派真生物提供的滴度是1E+13GC/ml以上; V.G./ml:Vector Genomes/ml的缩写,也是表示AAV病毒载体的滴度,等同于GC/ml。也是指每ml病毒液中含有的基因组拷贝数。通常用点杂交(dot-blotting)方法、QC-PCR方法、real time-PCR方法来测定。通常在测定前对样品用DNaseI处理,因此该滴度表示方法一般指每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。

5、rAAV有哪些血清型?如何选择合适的血清型?

现阶段已经发现的AAV有10多种血清型(AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9/PHP.eB/PHP.B/PHP.S/rh10/DJ/2-retro)以及多种突变型。由于cap衣壳蛋白的氨基酸序列和空间结构的不同,识别与结合的细胞表面受体也有很大的差异,所以导致不同血清型AAV感染的细胞和组织类型和感染效率也各不相同。

文献中对各组织的AAV血清型感染能力可能存在不同结果,对于文献数据较少的靶组织,建议研究者用预实验测试确定最理想血清型,这也将是实验创新点之一。

细胞感染:AAVDJ(感染80%的细胞类型)和AAV6(感染血液来源的细胞)

6、客户定制服务项目(AAV载体构建)需要了解哪些信息?

① 客户是否有基因模板?如果有模板,需要测序验证之后提供给我们;

② 如果客户没有模板,需要合成基因?基因号、序列图谱、物种、基因长度;

③ 构建用什么启动子、需要添加什么标签或者荧光标记,是否要求几个基因共表达;

④ 注意AAV载体ITR之间的容量;

⑤ shRNA建议客户选择三个靶点,或者选择一个经过验证的靶点;我们帮忙设计的话,不保证感染效率,建议客户可以先用构建好的质粒在体外筛选一个最佳的感染靶点,再进行AAV病毒的包装。

7、AAV纯化的方法及QC检测指标有哪些?

派真生物采用碘克沙醇 密度梯度离心的方法进行纯化;

派真生物的QC检测指标:

① 纯度:通过跑SDS-PAGE考马斯亮蓝染色观察纯度;

② 滴度:派真生物用ATCC标准品做校正,用SYBR Green QPCR检测滴度,最后滴度可以达到1E+13GC/ml以上;

③ 内毒素检测:内毒素含量不超过10EU/ml;

④ TEM电镜(可选项目):通过电镜观察空壳率(Empty/Full Ratio),低于30%以下;

⑤ HPLC(可选项目):检测纯度;

⑥ 质谱分析(可选项目):确定AAV血清型;

⑦ ddPCR检测滴度(可选项目):没有标准品校正。

8、pH值测定是检测浓缩之前还是浓缩之后的pH?浓缩前后的pH是否会变化?如果是浓缩后,用pH计测定需要的样品量较多,是否会导致浪费?

pH值是rAAV成品放行必检项,如果希望节约样品,建议采用微量pH电极来实现,样品量一般仅需15uL-100uL。

9、装量怎么理解?

按照药典通则0942,最低装量检查法进行标示装量的检测。如有变动,建议与CDE沟通。

10、A260/A280反映的是DNA/蛋白的相对比值,它具体有什么意义?

A260/A280是DNA/蛋白的直观体现,对于rAAV而言,该指标可以侧面反映空壳率或者其他污染。当A260/A280过小,则空壳率可能偏高,当A260/A280过高,则其他污染可能过高。该方法的检测的优点是方便快捷,便于趋势跟踪。

11、一般来讲,蛋白杂质均来自宿主细胞和培养基,如果已经检测了宿主蛋白残留和BSA,再单独检测蛋白杂质又是基于什么考虑?

SDS-PAGE检测蛋白的目的是鉴别rAAV的衣壳蛋白条带,也能总体直观地反映蛋白杂质情况,除了宿主蛋白、BSA外,蛋白也可能是衣壳降解产物。

12、像rAAV这种非整合宿主基因组的病毒载体,如何检测感染滴度?

目前检验的金标准是采用TCID50,基本原理是基于辅助病毒adenovirus H5细胞实验再采用qPCR检测。

13、检测基因的表达和功能,考虑到之前已经用相同的质粒包rAAV完成体外实验和小鼠实验,所以这两项算是做过了,只要DNA序列正确,基因表达和功能检测可以不做吗 ?

基因表达跟工艺稳定性有关,也是属于效价(potency)的重要项。至于功能检测,建议与CDE沟通,从科学性角度做验证。

14、rcAAV是否指双链互补AAV?我的AAV非自身互补,不知检测该指标是基于什么考虑?

rcAAV是指复制完整型AAV(replication competent AAV),是对具有复制能力的AAV做残留限定,也是法规要求的重点项目,从评审的角度涉及安全性的检验项目是重点关注的项目。

15、不溶性微粒,不知这项中的不溶性微粒与外观可见异物和可见异物项目有何区别?

外观可见异物的检验方法是目测法,主要标准是无50μm以上异物,可见异物系指存在于注射剂、眼用液体制剂和无菌原料药中,在规定条件下目视可以观测到的不溶性物质,其粒径或长度通常大于50μm,此项目针对所有液体制剂【参引药典通则0904】。

不溶性微粒的检验方法通常采用不溶性微粒仪,关注的微粒范围为含10μm及以上的微粒。针对检查静脉用注射剂(溶液型注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液)及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量,可根据自己项目性质进行评估。【参引药典通则 0903】

16、对于支原体和细菌内毒素,是基于安评的考虑,之前已经做了两批小鼠实验,结果都没问题,这两项是否可以不做?

基因治疗国内法规参见CDE颁布《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》需进行该支原体、内毒素的检验。如有疑问,建议与中检院、CDE做沟通。

17、派真生物单次发酵的生产体积?对应的AAV产量是多少?

单次贴壁发酵体积:1L, 5L, 25L, 50L, 200L,均为单个反应器。不同AAV血清型和不同载体基因的产量可能不同,以AAV9(以中高产血清型为例), 1L产量约1E+14GC,50L约1E+16GC,100L约2E+16GC,建议完成必要的工艺开发和批次稳定性验证。

18、Genome copy/mL(GC/mL)与 vg/mL(virus genome/mL)的单位是否具有换算关系?派真测定腺相关病毒GC/mL是采用何种方法?如果是q-PCR,是采用病毒自身特异引物,还是采用插入表达序列特异性引物?

enome copy/mL=gc/ml= vg/mL(virus genome/mL)。测定GC采用q-PCR和ddPCR两种方式。qPCR涉及标曲标准品的标定;ddPCR可以设置参比品质控,非必需项。ddPCR在精密度的验证上%RSD更低,特别是中间精密度。qPCR更容易存在实验室间与操作人员间的偏差。工艺摸索和中间品主要采用qPCR,终特色服务的滴度通常用ddPCR。GC方法开发可采用GOI靶基因的特异性引物,前期开发阶段也可采用polyA或者ITR等元件作为通用型检测。GMP特色服务建议用特异性引物,终特色服务滴度检验均基于特异性引物检验放行的。

19、对于包装生产的腺相关病毒成品,有否对空壳率进行测定,用什么方法,空壳率维持在一个什么样的水平?

通常采用AUC、TEM、CyroTEM、或者VG TITER/CAPSID TITER,但是AUC、TEM、CyroTEM不适合作为QC放行用,用于质量研究和工艺开发用会更好。目前采用阴离子色谱HPLC进行方法开发,派真可以提供分析方法开发服务并与CyroTEM、AUC检验结果进行比对验证。

空壳率每个血清型用柱层析得到的空壳率都有不同,派真生物生产AAV9可以通过工艺优化控制在10%以内的水平。

20、细胞库的检定是否按照中国药典2015三部通则《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》进行?

是的

21、通用检项中未见HIV,HBV,HCV检测,无热原质试验,野毒检测,这些是否需要检测,但是不属于通用检项?

特色服务收获液会根据工艺特性进行外源病毒因子检测,不列入原液和成品标准中。

22、目前分析方法可接受的误差或偏差范围?

一般生化类方法的%RSD通常为15%-25%,ddPCR接受标准为70%-130%,但通常验证数据为<5%,TCID50的%RSD为小于100%。

23、对于批次送检的样本,有什么送样量的要求吗?

建议单次委托快递送样量不低于50uL体积,避免冻融、蒸发、管壁的影响。基因组滴度、质粒DNA残留、rcAAV等建议送样量10ul以上,感染滴度送样量建议20 ul以上,检测空壳率的送样量建议达到5×1013vg。

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