知识分享

慢病毒包装实验后的耗材处理需要严格遵守生物安全规范，避免病毒污染环境和人员感染。以下是常规处理步骤和注意事项： 1. 灭活处理 慢病毒属于生物安全等级 BSL-2 的病原体，所有直接接触病毒的耗材（如吸头、离心管、培养皿等）必须彻底灭活： 化学灭活：使用含 1% 次氯酸钠（有效氯浓度）的消毒液浸泡至少 30 分钟。 物理灭活：高压灭菌（121°C, 20-30 分钟）是最可靠的方法，适用于可耐受高温的耗材（如玻璃器皿、金属器械）。 2. 分类处理 根据耗材类型和污染程度分类处置： 固体废弃物（枪头、离心管、培养皿等）：...

Cas12a基因敲入小鼠在多重基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程中的应用 研究概述 2025年3月20日，耶鲁大学助理教授陈斯迪博士在Nature Biomedical Engineering期刊发表标题为“Cas12a-knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune-cell...

AAV血清型筛选有多种常见方法，这些方法各有特点，可以根据具体的研究需求和应用场景选择合适的技术。以下是几种常见的AAV血清型筛选方法： 1. 体外细胞实验筛选 原理：通过在体外培养的细胞中测试不同AAV血清型的转染效率和基因表达水平，筛选出最适合特定细胞类型的AAV血清型。 步骤： 准备细胞系：选择与研究目标相关的细胞系，例如神经元细胞、肝细胞、心肌细胞等。 构建AAV载体库：制备包含不同血清型的AAV载体。 转染细胞：将不同血清型的AAV载体分别转染到细胞中。...

腺相关病毒（AAV）的包装容量主要受其衣壳物理空间的限制，通常认为其最大包装能力约为 4.7–5.0 kb（千碱基对）。这一限制源于AAV天然基因组的长度（约4.7 kb），超出此范围的DNA可能无法被有效包装到病毒颗粒中，导致产量显著下降或载体不稳定。 1.天然限制 AAV的基因组是单链DNA，包含两个开放阅读框（Rep和Cap）及两端的反向末端重复序列（ITRs）。为成功包装，外源基因（包括启动子、目的基因、polyA信号等）的总长度需控制在 4.7–5.0 kb以内。 2.超容量的挑战 超过5.0...

AAV-PHP.eB 是一种腺相关病毒（AAV）血清型载体，专门优化用于高效地穿越血脑屏障（BBB），从而实现全脑基因递送。与 AAV-PHP.B 相比，AAV-PHP.eB 具有更高的中枢神经系统（CNS）转导效率，在小鼠模型中展现出更强的基因表达能力。 AAV-PHP.eB 的特点 1.高效穿越血脑屏障（BBB） 适用于 系统给药（如静脉注射），可实现广泛的中枢神经系统转导。 2.增强的基因递送效率 相比 AAV-PHP.B，提高了数倍的 CNS 细胞转导效率，适用于神经疾病研究。 3.靶向性 在小鼠模型中，对...

在GMP（Good Manufacturing Practice，良好生产规范）体系下，AAV（腺相关病毒）生产必须符合严格的质量标准，以确保产品的安全性、纯度和一致性。以下是GMP AAV生产的主要要求： 1. 设施与环境 生产需在符合GMP标准的洁净车间进行，通常要求B级或C级洁净度（具体等级取决于生产步骤）。 采用单向流设计，避免交叉污染。 需配备HVAC系统（空气过滤系统）以控制微生物和颗粒污染。 2. 质量管理体系 建立完善的SOP（标准操作程序），涵盖所有生产和质量控制步骤。 符合ICH Q7（API...

GFP（绿色荧光蛋白）和 mCherry（红色荧光蛋白）都是常用的荧光蛋白标签，它们的主要区别如下： 1. 荧光颜色 GFP（Green Fluorescent Protein）：发出绿色荧光，激发波长约 488 nm，发射波长约 509 nm。 mCherry：发出红色荧光，激发波长约 587 nm，发射波长约 610 nm。 2. 光稳定性 GFP：光稳定性较好，适合长时间成像。 mCherry：比许多其他红色荧光蛋白（如DsRed）更稳定，但光稳定性通常略逊于GFP。 3. 光漂白耐受性...

空载体本身通常不会在荧光显微镜下显示荧光，除非它携带了特定的荧光基因或荧光标记。例如： 1、如果你的质粒带有荧光蛋白（如GFP、RFP、mCherry等） 只有在质粒成功转录并翻译成荧光蛋白后，细胞才会发出荧光。 这通常需要质粒进入细胞核（真核细胞）或直接在细胞质中表达（原核细胞）。 2、如果是空载体（无荧光基因） 质粒DNA本身不会发出荧光，因此无法在荧光显微镜下直接观察到。 但可以通过与荧光染料（如Hoechst染细胞核，PI染DNA等）结合，间接观察质粒的影响。 3、如果质粒带有荧光标记（如Cy3、Cy5等荧光探针）...

过表达慢病毒（Lentivirus）是基因功能研究中常用的工具，通过将目的基因导入靶细胞实现稳定过表达。实验中需要合理设计对照以排除非特异性效应，确保实验结果的可靠性。以下是关于过表达慢病毒及其对照的关键点： 一、过表达慢病毒实验设计 过表达慢病毒载体构建 目的基因克隆：将靶基因插入慢病毒载体（如pLVX、pCDH等），通常使用强启动子（如CMV、EF1α）驱动表达。 标记基因：多数载体携带荧光标记（如GFP、mCherry）或抗性基因（如Puromycin），便于感染后筛选。...

EF1α（Elongation Factor-1 Alpha）和CMV（Cytomegalovirus）是两种常见的启动子，各有优缺点。相比CMV启动子，EF1α启动子具有以下优势： 1. 表达稳定性更强 CMV启动子 容易受到基因沉默（尤其在长期培养的哺乳动物细胞中）或甲基化的影响，导致外源基因表达水平下降。 EF1α启动子 具有较强的抗沉默能力，在长时间培养或体内实验中能维持较为稳定的基因表达。 2. 适用于更广泛的细胞类型 CMV启动子 在某些细胞类型（如干细胞、神经细胞或某些原代细胞）中可能表现较弱。 EF1α启动子...