胥春龙/周英思/杨辉使用超紧凑Cas12f1对酪氨酸血症的体内治疗

三种不同的Cas12f1直链同源物最近被证明在HEK293T细胞中具有核酸酶活性。为了研究它们在小鼠细胞中的活性，研究者首先针对小鼠Trp53基因的几个基因组位点设计了25种针对AsCas12f1、SpCas12f1和Un1Cas12f1的引导RNA（gRNA）。用三种Cas12f1直向同源物和Trp53靶向gRNA转染小鼠N2a细胞，并通过深度测序分析基因编辑效率。Un1Cas12f1在25个靶位点中的5个靶位点产生了10%的基因编辑率；然而，研究者没有观察到AsCas12f1或SpCas12f1可检测到indel。因此，选择Un1Cas12f1进行以下实验。

为了进一步证实Un1Cas12f1在小鼠细胞中的活性，研究者发现在另外两个基因Tyr和Hpd上，Un1Cas12 f1可以分别产生10%和8%的编辑效率。为了检测Cas12f1在胚胎中的用途，通过显微注射将体外转录的Un1Cas12f1 mRNA和靶向Hpd或Tyr基因的gRNA引入小鼠受精卵胚胎中。通过注射Hpd靶向gRNA产生的敲除小鼠显示出20%的基因编辑率，是N2a细胞的两倍。类似地，如基因分型结果所示，靶向Tyr基因的gRNA表现出高达20%的indel效率，并有力地破坏了Tyr基因。基于小鼠N2a细胞和胚胎中Cas12f1介导的编辑结果，研究者假设Cas12f1可以通过在成年组织中单次AAV递送应用于治疗疾病，考虑到Cas12f1的超紧凑尺寸。

研究者使用酪氨酸血症小鼠模型探索了Cas12f1的治疗潜力，其中Fah基因的功能缺失突变导致遗传性I型酪氨酸血症（HTI）并导致致命的肝损伤。Hpd基因编码的4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶失活可以改善表型，使肝细胞转化为健康无症状状态。因此，研究者选择Hpd基因作为治疗靶点，测试Cas12f1对HTI的体内治疗效果。另一个小的Cas9核酸酶CjCas9作为阳性对照。

为了研究Cas12f1在体内的脱靶效应，研究者用Cas12f1和CjCas9的OFFinder和扩增子测序预测并分析了10个潜在的脱靶位点。在Cas12f1或CjCas9治疗组的预测脱靶基因座上均未观察到可检测的indel突变。此外，研究者使用PEM-seq进行了全基因组脱靶分析，以评估Cas12f1诱导的脱靶效应。PEM-seq在Cas12f1介导的基因敲除中未检测到脱靶编辑事件。这些结果表明，在该酪氨酸血症小鼠模型中，Cas12f1在拯救肝脏表型方面表现出与CjCas9相当的疗效和脱靶特性。

尽管发现了越来越多的不同Cas9和Cas12直链同源物，但大多数直链同源体的组成约为1000氨基酸，这使得通过AAV递送它们变得麻烦。最近，只有约500 氨基酸的Cas12f1在真核细胞中被证明具有核酸酶活性，显示出其作为基于AAV的基因治疗系统的巨大潜力。为了拓宽Cas12f1的应用，有必要进一步提高基因编辑活性，降低PAM序列的复杂性，使更多的基因组基因座能够编辑。尽管在研究中未观察到明显的脱靶和毒性，但在Cas12f1可用于人体环境之前，有必要对脱靶和其他安全问题进行长期评估。鉴于其超紧凑的尺寸，这些发现突出了Un1Cas12f1体内编辑作为遗传疾病可能治疗方法的潜力。