载体转导细胞表达抗原可诱导免疫应答，抗原表达的持久性通常与抗体和T细胞应答的持久性相关。此外，抗原在载体颗粒表面或病毒粒子内部的存在也有助于诱导免疫反应。虽然复制缺陷病毒载体通常比复制载体更安全，但其需要更高的剂量或初始强化方案才能引起足够的免疫，并且根据具体应用，使用复制载体可能仍然是首选。复制载体的一个优点是可模仿自然感染，导致细胞因子和共刺激分子的诱导，提供有效的辅助作用。当复制缺陷病毒载体不能刺激最适当的应答时，可能需要结合佐剂来增强针对编码抗原的免疫应答。病毒载体疫苗可以进一步优化，以提高靶细胞中的转基因表达，同时递送两种抗原，在重复免疫中绕过预先存在的免疫，并减少潜在的副作用。
在临床前和临床试验中，病毒载体已被用作多种传染病的疫苗，如艾滋病毒、疟疾、埃博拉病毒，以及最近的SARS-CoV-2.它们在免疫原性、安全性和有效性方面都有各自的益处和风险。
腺病毒载体疫苗
图1 腺病毒5线性基因组和Ad5载体的示意图
几种腺病毒载体目前正被用作疫苗递送系统。腺病毒(Ad)是一个不同的DNA病毒家族，可引起宿主的呼吸道、眼部和胃肠道上皮的感染，其基因组是线性和双链的。腺病毒作为疫苗开发的病毒载体有以下优点：相对较低的致病性、遗传安全性和缺乏与宿主基因组的整合。此外，Ad载体还具有强免疫原性、对不同细胞类型有效感染和转基因掺入能力等特点，在疫苗开发中具有广阔的应用前景。传统上，Ad载体是使用依赖于锚定的包装细胞系制造的。然后用氯化铯密度梯度离心法从裂解液中纯化病毒载体。为了大规模生产，载体在悬浮培养生物反应器中使用连续细胞系进行繁殖，如人胚胎视网膜细胞系(PER.C6)。纯化过程包括顺序层析或层析-串联超速离心法。
5型腺病毒
腺病毒5型具有诱导体液和细胞免疫应答的能力，已成为许多病毒载体疫苗研究和试验的常用载体。然而，这种载体的使用受到了Ad5免疫的阻碍，这可能会对疫苗诱导的免疫反应产生负面影响。随着基线抗Ad5中和抗体(nAb)滴度的增加，HIV感染的风险增加，这表明预先存在的Ad5免疫对接种该载体后的HIV感染有影响。一项旨在了解分步试验受试者对艾滋病毒易感性增加的初步研究表明，当先前对Ad5有免疫力的个人接种Ad5疫苗时，Ad5特异的CD4+T细胞将重新激活，成为HIV-1感染的目标。这一理论后来在随后的一项研究中被证明是错误的，该研究表明，在Ad5血清阳性和Ad5血清阴性的受试者中，Ad5特异性CD4+T细胞没有明显差异。最近的一项研究表明，CD8+T细胞对疫苗编码的人类白细胞抗原I适应的HIV-1表位的激发促进了树突状细胞(DC)介导的CD4+T细胞在Ad5疫苗接种者中的反式感染。
一项随机、双盲、安慰剂对照的复制缺陷Ad5载体表达SARS-CoV-2刺突基因的2期试验的初步免疫原性数据表明，一次剂量足以诱导显著的抗体和细胞毒性T细胞反应，并且疫苗总体上是安全的。在俄罗斯进行的另一项研究考察了使用rAd5载体与rAd26结合的SARS-CoV-2疫苗的安全性和有效性。在这项随机、双盲、安慰剂对照的3期试验中，该疫苗被证明是安全的，对SARS-CoV-2感染的有效性为91.6%。截至2022年2月，该疫苗在紧急使用授权下使用后获得了俄罗斯卫生部的全面批准。
针对SARS-CoV-2的基于Ad5的雾化疫苗也在1期临床试验中进行了测试，结果显示耐受性良好，具有高度免疫原性。两剂雾化制剂诱导的T细胞反应和中和抗体滴度与肌肉注射一剂相同的疫苗相似，这支持了雾化疫苗的进一步评估。
尽管总体而言，Ad5病毒载体已被证明在大多数个体中是安全且具有免疫原性的，但对Ad5的预先免疫问题导致了基于不太流行的人类或动物腺病毒血清型的新型腺病毒载体的发展，如26型腺病毒(Ad26)和黑猩猩腺病毒(ChAd)。
26型腺病毒
腺病毒26型(Ad26)的血清价低于Ad5.使其成为开发基于腺病毒载体的疫苗的理想选择。基于Ad26的载体已被证明是安全的，能够诱导体液和细胞介导的反应。在一项小型临床试验中，健康成人口服单剂量高度减毒的Ad26-HIV-1复制能力疫苗，未检测到抗原特异性免疫反应，这表明病毒载体的复制能力明显受损。虽然研究疫苗被发现是安全的，在试验参与者中没有严重的不良事件，但其不能预防艾滋病毒感染，因此试验停止。最近，一种针对SARS-CoV-2的基于Ad26载体的疫苗已被批准用于紧急使用，以对抗COVID-19大流行。Ad26.COV2.S疫苗是一种重组的、不能复制的Ad26载体，编码全长SARS-CoV-2刺突基因。在随机、双盲、安慰剂对照的三期试验中，单剂疫苗显示安全有效，不良反应轻微。尽管该疫苗在2/3期试验中被证明是安全的，但在美国食品和药物管理局(FDA)批准紧急使用后，在接种疫苗后6至15天内，60岁以下女性中报告了几例静脉血栓形成和血小板减少症。为了进一步调查这些报告的副作用，暂停了一段时间后，由于已知和潜在的益处超过已知和潜在的风险，重新开始使用这种疫苗。这种疫苗尚未得到FDA的全面批准。
黑猩猩腺病毒
基于黑猩猩腺病毒(ChAd)血清型的腺病毒载体已经开发出来，并针对几种病原体进行了测试，包括狂犬病、中东呼吸综合征和最近的SARS-CoV-2.在Zhou等人的一项研究中，用基于ChAd载体的抗狂犬病疫苗口服/鼻内免疫可诱导持续的粘膜抗体反应和对鼻内病毒攻击的保护。针对SARS-CoV-2的ChAdOx1 nCov-19疫苗于2020年迅速进入三期临床试验，并随后在几个国家获得紧急使用许可。尽管该疫苗在2/3期试验中被证明是安全的，但在紧急使用授权后，在34-54岁的疫苗接种者中，在第一剂疫苗接种后7-14天内报告了几例静脉血栓形成和血小板减少症。Shultz等分析了5例在首次接种ChAdOx1 nCoV-19疫苗后7-10天出现静脉血栓形成和血小板减少的患者，发现所有患者的血小板因子4 (PF4)-多阴离子复合物抗体水平均较高。腺病毒载体疫苗在一小部分接种疫苗的个体中触发抗PF4抗体产生的确切机制尚不清楚。初步假设包括疫苗成分与PF4结合并产生新抗原的可能性。事实上，在Baker等人最近的一项优雅的研究中，作者证明了PF4能够与几种腺病毒(包括ChAdOx1、ad5和Ad2637)形成稳定的复合物。这些Ad/PF4复合物可以诱导抗PF4自身抗体。由于PF4与这些载体表面的高变区(HVR)残基接触，替换对这种相互作用重要的氨基酸可能导致更安全的腺病毒载体的发展。
腺相关病毒（AAV）载体疫苗
图2 AAV基因组和AAV载体的示意图
腺相关病毒属于细小病毒科，是基因组由4.8kb线性单链DNA组成的非包膜病毒。由于AAV载体具有相对较低免疫原性、较高安全性、广泛趋向性以及维持长期基因表达的倾向，因此AAV载体是基因治疗和治疗性抗体递送最普遍的选择。用转基因、包装和辅助质粒转染人胚胎肾(HEK)293T细胞可制备AVV载体。载体颗粒可以通过聚乙二醇(PEG)沉淀、PH介导的蛋白质去除和亲和层析纯化。虽然AAV载体主要用于治疗眼部和肌肉疾病，但近年来它们作为疫苗载体的使用已增加，用于治疗和预防传染病，如艾滋病毒，HPV和流感。几项研究指出，AAV载体疫苗只需一次剂量即可诱导强烈且持久的抗体反应，无需佐剂。与DNA、重组蛋白、灭活病毒或病毒样颗粒(VLP)等其他疫苗接种策略相比，AAV载体疫苗还显示出更高或更持久的抗体应答。然而，与其他病毒载体相比，AAV载体被认为具有低免疫原性。多种AAV血清型和衣壳变体的分离为开发引物/增强策略提供了可能性，其中AAV衣壳可以切换，以避免引物后诱导的抗衣壳中和抗体反应。AAV载体的主要缺点包括有限的转基因能力和人类广泛的预先免疫。目前正在评估提高AAV免疫原性和规避已有免疫的策略。然而，重组AAV载体是提供单克隆抗体和免疫球蛋白衍生物的被动免疫载体的选择，因为其能够维持长期表达和高水平的这些治疗药物。
水疱性口炎媒介疫苗
图3 野生型VSV和rVSV载体的示意图
水疱性口炎病毒(VSV)属于横纹病毒科，是一种单链负义RNA病毒，其特征为子弹状。VSV通常感染牛、马、猪和山羊，引起牙龈、嘴唇、舌头、鼻孔和乳房的病变，有时伴有发烧和过多的唾液，也可能会发生人际传播，但最常导致无症状感染。病毒基因组是非分段的，编码N、P、M、G和L蛋白，G蛋白或糖蛋白介导病毒颗粒附着到宿主细胞上。VSV是一个有价值的疫苗平台，因其能够以高滴度复制，血清阳性率低，并且在人类中几乎没有预先存在的免疫力。以VSV为基础的疫苗是通过用重组VSV质粒转染稳定表达T7聚合酶(BHK-T7)或HEK293T的哺乳动物细胞来生产的，重组VSV质粒表达感兴趣的转基因来代替病毒的G基因。重组病毒通过感染非洲绿猴肾细胞系Vero或HEK-293细胞进一步繁殖。对于rVSV的大规模生产，离子交换柱用于纯化病毒，并通过切向流超滤进一步浓缩。基于VSV的重组病毒载体(rVSV)已在临床前和临床试验中证明了安全性和免疫原性，一种基于VSV的埃博拉疫苗(rVSV-ZEBOV)最近已被批准用于人类。rVSV-ZEBOV疫苗缺乏VSV的G基因，该基因负责野生型病毒感染多种细胞类型的能力，并表达埃博拉糖蛋白(GP)。涉及rVSV-ZEBOV疫苗的临床试验于2018年底结束，结果证明该疫苗在不同人群中都非常有效。有趣的是，临床前研究和临床研究的结果都显示了高水平的中和性IgM的诱导，这表明这种抗体同型可能在疫苗诱导的针对EBOV的免疫中发挥重要作用。正在对rVSV平台进行评估，以开发针对其他丝状病毒的疫苗，包括苏丹病毒(SUDV)和本迪布焦病毒(BDBV)，以及冠状病毒、寨卡病毒和刚果出血热，所有这些研究都显示出有希望的结果。
整合酶缺陷慢病毒载体疫苗
图4 慢病毒载体系统的示意图概述
整合酶缺陷慢病毒载体(IDLVs)是一种很有前途的疫苗平台，因其能够在单次免疫后诱导高强度和非常持久的免疫反应。IDLV可以从HIV或SIV中获得，将病毒基因组分裂成不同的质粒，并使长末端重复序列(ITRs)、包装信号和整合酶基因发生突变，使它们具有复制缺陷和非整合性。IDLV是通过将HEK 293T细胞与所选择的转移质粒、包膜质粒和包装质粒共转染产生的，含有载体颗粒的培养上清液在20%蔗糖缓冲液上进行纯化和浓缩。对于大规模生产，载体可以在使用稳定包装细胞系的悬浮培养生物反应器中繁殖。IDLV以外生体形式存在于靶细胞中，并能在细胞的整个生命周期内产生编码蛋白。非整合表型是IDLV的一个重要的安全特征，因为整合载体具有插入突变的潜力。针对艾滋病毒、寨卡病毒、疟疾和SARS-CoV-2的基于IDLV的疫苗已在小鼠和恒河猴的多项临床前研究中使用，并显示出高免疫原性和持久的保护性免疫反应。IDLV是一种有吸引力的递送平台，因为人体内几乎没有预先存在的免疫，可以与水疱性口炎病毒G包膜糖蛋白(VSV.G)血清型交换策略相结合，以降低反复注射IDLV的抗媒介免疫。除了具有高度的免疫原性和诱导持久的反应外，IDLV还显示出良好的安全性。IDLV诱导的长期免疫可能归因于IDLV在体内的持久性。事实上，在注射后6个月，免疫NHPs的肌肉中仍然可以检测到逆转录的载体DNA，在小鼠注射后3个月的肌肉组织中，IHC和RT-PCR都证实了转基因的表达，表明IDLV可以提供持续的转基因表达。其他研究也显示了IDLV作为治疗性疫苗而非严格预防性疫苗的功效。表达SIV-Gag的IDLV治疗性免疫提高了慢性SHIV感染恒河猴的CD8+T细胞应答，并诱导了长时间的病毒控制。这些研究强调了IDLV作为预防和治疗疫苗的强大潜力。
痘病毒载体疫苗
图5 痘病毒基因组的示意图
痘病毒是一个复杂的包膜病毒大家族，包括牛痘病毒(VV)和天花病原体天花病毒。痘病毒具有双链DNA基因组，它们可以利用病毒聚合酶在细胞质中进行复制和转录。基于痘病毒的疫苗已用于预防各种传染病，如艾滋病毒-1、结核病和疟疾。使用痘病毒载体的一个优点是其携带异源基因的能力约为25kb，远远大于其他载体，这使得痘病毒载体成为针对不同病原体的多抗原疫苗的理想候选物。痘病毒载体通常在痘病毒感染的细胞中通过同源重组产生，常用的细胞系包括肾上皮细胞CV-1、Vero和BSC-40细胞。用重组转移质粒转染感染痘病毒细胞，产生的重组载体可在易感细胞中进一步繁殖。载体颗粒在蔗糖垫上进行超离心纯化。大规模生产时，采用离子交换和凝胶过滤色谱法纯化痘病毒载体。
痘病毒载体显示出高度的免疫原性，能够诱导强烈的免疫反应。由于宿主范围的限制，这些病毒载体在人类中自然存在复制缺陷，或者可以通过在禽类细胞中连续传代而导致复制缺陷，如修饰的安卡拉牛痘(MVA)，这会导致感染人类细胞所需基因的丢失。一种痘病毒类型已显示出作为疫苗传递平台的希望，即修饰的安卡拉牛痘(MVA)载体。一项MVA载体的HIV-1马赛克二价疫苗的研究表明，体液和细胞介导的免疫反应可以在人类中引起。该疫苗也是安全的，耐受性良好，具有免疫原性。另一种用于疫苗研究的复制缺陷VV毒株是纽约疫苗病毒(NYVAC)。具有HIV gagpol-nef抗原和病毒包膜基因的NYVAC重组载体已被证明可促进CD4+和CD8+T细胞反应。同样的研究表明，虽然MVA/NYVAC载体组合产生广泛的免疫反应，但DNA/NYVAC载体组合产生更强的免疫反应。最近的一项研究进一步支持了这些结果，该研究观察了DNA载体、NYVAC载体以及两者结合的功效。该研究表明，两种载体的结合导致了更早和更有效的抗体反应。
异源病毒载体疫苗
异源病毒载体疫苗(HVVV)由编码相同或不同抗原的两种或两种以上载体的组合组成，这些载体可以一起施用，也可以采用初级/加强方案。与同源载体疫苗接种相比，HVVV免疫可诱导更高强度和更持久的免疫反应。
HVVV策略最近被临床用作一种新的埃博拉候选疫苗，使用表达野生型埃博拉糖蛋白(ChAd3-EBO-Z)的重组复制缺陷型黑猩猩血清3型腺病毒(ChAd3)载体作为引物，并使用表达相同抗原(MVA-EBO-Z)的MVA载体作为增强剂。在40名健康的英国志愿者中进行了1a期研究，以评估单独MVA-EBO-Z和ChAd3-EBOZ的异源初始增强方案之后MVA-EBO-Z的安全性和免疫原性。1b期试验在40名同年龄段(18-50岁)接受异源疫苗的塞内加尔成年人中进行。塞内加尔志愿者刺激后的体液反应明显低于英国队列，这可能是由于病原体暴露负担增加、遗传差异、微生物群组成和营养状况所致。仅接种MVA疫苗组的抗体滴度和细胞免疫应答明显低于接种异源ChAd3-EBO-Z原疫苗组和MVA-EBO-Z增强疫苗组，支持使用异源疫苗增加免疫应答的程度。
根据异种疫苗接种中使用的病毒载体的组合，可以诱导不同类型的免疫反应。这在一项评估初强化免疫策略对人类疟疾的免疫原性和保护效果的研究中得到了证实。在本研究中，使用了3种疫苗平台，包括质粒DNA、MVA载体和禽痘FP9减毒株，用于不同的初始/增强组合。研究结果表明，不同的载体需要以特定的顺序使用，以诱导最佳的IFN-γ响应。特别是DNA引物加MVA增强和FP9引物加MVA增强是最具免疫原性的，并诱导了广泛特异性的IFN gamma应答，对两种恶性疟原虫具有交叉反应性。
除了HVVV策略外，病毒载体也被用于基于DNA或mRNA的疫苗的启动-增强策略。值得注意的是，由于上述罕见的不良反应，基于腺病毒的ChAdOx1 COVID-19疫苗的停止，导致部分接种个体接受单剂ChAdOx1和第二剂辉瑞BNT162b2 mRNA疫苗或Moderna mRNA-1273疫苗的加强接种。当比较同源接种ChAdOx1与异源接种ChAdOx1和mRNA的保护作用时，一些研究发现后者的保护作用更强。当将异种载体/mRNA方案与同源mRNA方案进行比较时，异种疫苗接种导致更高水平的尖刺特异性CD8+T细胞。这些研究支持探索使用不同平台的异源疫苗接种策略，因为载体/mRNA方案可能改善免疫原性。
昆虫特异性病毒病毒载体疫苗
近年来出现了基于昆虫特异性病毒(ISV)的病毒载体。其中一些病毒属于与动物虫媒病毒病原体相关的病毒科，如黄病毒科、托加病毒科和苯病毒科，但它们的复制通常仅限于昆虫。这些ISV已被设计用于生产嵌合颗粒疫苗，表达嵌合抗原，用于一系列脊椎动物感染病毒，包括黄病毒和托加病毒。虽然这些嵌合疫苗病毒在脊椎动物细胞中存在复制缺陷，但它们在昆虫细胞中生长到高滴度，并且它们的颗粒在抗原性和结构上与相应的野生型病毒病原体难以区分。两种蚊媒α病毒，即ISV埃拉特病毒(EILV)和人致病性基孔肯雅病毒(CHIKV)之间的嵌合疫苗在小鼠中诱导抗体和T细胞反应，并在单次注射后保护NHPs免受CHIKV感染。与小鼠研究不同的是，接种疫苗和未接种疫苗的NHPs之间没有检测到T细胞反应的显著差异，证明了nAbs在病毒攻击中的保护作用。
病毒载体已经存在了40多年，其中许多载体已经被使用，目前正在被用作预防传染病的疫苗。SARS-CoV-2大流行推动了病毒载体疫苗的开发，并突出了其中一些平台的优势和局限性。需要对这些载体进行进一步的工程设计，以提高反应性、有效性和载体剂量。
资料来源
1.公众号生物制品圈
https://mp.weixin.qq.com/s/li_DF4IbF2mL8UPAindVzw