CRISPR/Cas9技术能够精准地编辑细胞中的基因。腺病毒作为一种高效载体，可以携带CRISPR/Cas9系统进入目标细胞进行基因修饰。以下是运用腺病毒实现CRISPR/Cas9基因编辑的一般构建流程：
一、设计靶向序列
首先，根据需要修改的基因确定一个适当的靶向序列，通常为20个核苷酸长度，并确保该序列在细胞基因组中的唯一性，以减少非特异性编辑的可能性。这个靶向序列将用于指导Cas9蛋白识别并切割基因组DNA。
二、构建导向RNA(gRNA)
设计并合成含有目标靶点互补序列的导向RNA。gRNA是CRISPR/Cas9系统中的关键组件，负责将Cas9酶导向正确的基因位点。
三、腺病毒载体的选择和制备
根据研究需求，选择一种适宜的腺病毒载体，例如Ad5或其他血清型的腺病毒载体。常见的腺病毒载体包括第一代、第二代和缺陷辅助型腺病毒。载体的构建包括插入gRNA表达盒以及Cas9蛋白的编码序列。
四、克隆至腺病毒表达载体
在实验中，可通过重组DNA技术将gRNA和Cas9基因接入到腺病毒的表达载体，这通常包括利用限制性酶切位点或同源重组等策略。
五、包装和放大腺病毒颗粒
涉及将重组的基因载体转染入包装线细胞(如HEK293)中，这些线细胞提供腺病毒生命周期所需的所有额外因子。转染之后，这些细胞将产生感染性的腺病毒颗粒，它们含有CRISPR/Cas9构件。进一步通过增殖、纯化腺病毒颗粒从而提供足够的病毒用于感染目标细胞。
六、验证和滴度测定
在感染目标细胞之前，需要通过实验验证所构建的腺病毒是否正确表达gRNA和Cas9.通过PCR、测序等方法确认载体序列的正确性。随后，通过滴度测定来确定病毒的感染效率，常用的滴度测定方法包括荧光聚合酶链式反应(qPCR)和组织培养感染剂量50(TCID50)。
七、目标细胞的感染
将验证过且测定滴度的腺病毒引入目标细胞进行感染。感染后，病毒将释放包含gRNA和Cas9的遗传材料进入细胞内，进而实现对特定基因位点的编辑。
八、后续分析
感染后，通过一系列分子生物学和细胞生物学方法监测基因的编辑效果，包括实时PCR、Western blot分析Cas9蛋白的表达，以及利用T7内切酶实验和测序技术检测编辑位点。
九、应用和功能验证
最后，通过各种细胞学和分子学技术验证CRISPR/Cas9介导的基因编辑对细胞功能的影响，如增殖、迁移、分化等实验。
总结：以上步骤涵盖了从 设计、构建到验证CRISPR/Cas9腺病毒载体的全流程。此流程在基因治疗、药物筛选以及基础生物学研究中有着广泛的应用。随着技术的不断完善和优化，CRISPR/Cas9腺病毒载体将会成为基因编辑领域更加强大的工具。