Cas9基因敲除是一种基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术，用于在基因组中精准敲除目标基因。Cas9基因敲除的原理依赖于Cas9核酸酶与向导RNA（sgRNA）的协同作用，能够切割特定的DNA序列，触发细胞修复机制，从而导致基因的功能失效。以下是该技术的具体工作机制和原理：
1. CRISPR-Cas9系统的核心组成
- Cas9核酸酶：CRISPR系统中的关键酶，能够在目标DNA序列的特定位置引发双链断裂（Double-Strand Break，DSB）。
- 单链向导RNA（sgRNA）：向导RNA由CRISPR RNA（crRNA）和转录激活RNA（tracrRNA）组成，负责引导Cas9蛋白定位到目标基因序列。sgRNA包含一个20个碱基的序列，能够与目标DNA中的互补序列（PAM序列附近）结合。
2. Cas9基因敲除的工作原理
（1）设计向导RNA（sgRNA）
- 向导RNA的序列设计基于目标基因中的特定DNA序列，它必须靶向位于一个PAM序列（5′-NGG-3’）附近的区域，PAM是Cas9识别的序列。
- sgRNA与靶向基因的20个碱基序列互补结合，起到定位作用。
（2）sgRNA引导Cas9定位并切割DNA
- sgRNA与Cas9蛋白结合，形成一个复合物。该复合物通过sgRNA引导Cas9蛋白识别并结合靶向基因的目标DNA序列。
- 当Cas9到达指定位置后，它会在目标序列的PAM序列旁边引发双链DNA断裂。
（3）细胞修复机制的启动
Cas9切割DNA后，细胞会启动内源性的DNA修复机制。基因敲除的关键在于利用这些修复途径：
- 非同源末端连接（NHEJ，Non-Homologous End Joining）：
- 这是细胞修复双链断裂的主要方式之一。NHEJ是一种高效但低保真的修复途径，在修复过程中，DNA两端可能会出现小片段的插入或缺失（Indels）。
- 基因敲除的实现：由于NHEJ修复的低保真性，导致框移突变或提前终止密码子形成，从而破坏了目标基因的阅读框，导致基因功能失效，即基因敲除。
- 同源重组修复（HDR，Homology-Directed Repair）（非主要机制，用于基因敲入）：
- 如果细胞提供一个外源的DNA模板，HDR可以在修复过程中插入特定的外源基因。但基因敲除一般不依赖HDR，而主要通过NHEJ实现。
3. 基因敲除的结果
- 基因功能丧失：由于NHEJ修复中产生的插入或缺失，目标基因的编码区发生突变，通常导致移码突变或非功能性蛋白的表达，进而使基因失去功能。
- 功能性基因敲除：通过基因敲除，科学家可以研究特定基因的功能、基因在疾病中的作用机制，以及开发新的治疗方法。
4. Cas9基因敲除的应用
- 基础研究：研究特定基因在生物体中的功能。
- 疾病模型：创建基因敲除的小鼠或其他模型生物，用于研究遗传性疾病的分子机制。
- 基因治疗：通过敲除致病基因，治疗遗传病或癌症等疾病。
- 药物研发：筛选重要的基因靶点，开发新型药物。
CRISPR-Cas9基因敲除的流程示意图
1. 设计sgRNA → 2. sgRNA与Cas9结合形成复合物 → 3. 定位并切割目标DNA → 4. 细胞修复（NHEJ） → 5. 基因突变（敲除基因功能）
CRISPR-Cas9基因敲除通过设计特异性sgRNA，引导Cas9蛋白精确切割目标基因，然后通过细胞的非同源末端连接修复机制引发基因突变，导致基因功能丧失。这种技术具有高效、简便、成本低的特点，广泛应用于基因功能研究、疾病模型构建和基因治疗领域。