近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。上两篇我们分别学习了AAV的基础知识和AAV的载体开发，下面我们继续探索关于AAV的生产工艺。
方法概述
不断增长的重组腺相关病毒（rAAV）基因治疗产品临床应用需求（1.0×10^15~1.0×10^16 vg/dose），对rAAV的产量和质量提出了越来越高的要求，以确保其安全性、有效性、质量稳定性和成本可及性。由于rAAV无法独立复制，其生产需要同时表达辅助病毒基因和rAAV特异性的Rep和Cap基因，以复制和包装目的基因载体。rAAV的生产方法大致可以分为两类，即瞬时转染和病毒感染。基于瞬时转染的rAAV生产方法中，由肖啸等人开发的质粒共转染HEK293细胞是使用最广泛的生产系统。对基于病毒感染的rAAV生产方法来说，最常用的有三种不同的病毒，包括AAV的天然辅助病毒，腺病毒（Ad）和单纯疱疹病毒（HSV），以及用于生产的杆状病毒（baculovirus）。rAAV的生产还需使用哺乳动物细胞（例如HeLa、A549和HEK293）或昆虫细胞（例如Spodoptera frugiperda，Sf9）（图1）。四环素诱导自沉默腺病毒（TESSA）是另一种基于病毒感染HEK293细胞的大规模rAAV生产系统。以上这些生产方法在灵活性、质量、可放大性等方面各有其独特的优势和局限性，将在下面更详细地讨论。
图1 当前生产重组腺相关病毒（rAAV）的方法。目前主要的rAAV生产系统有：基于瞬时转染的和基于辅助病毒感染的系统。使用HEK293细胞进行三质粒瞬时转染仍然是最广泛使用的方法，而杆状病毒（BV）系统、Ad5腺病毒系统、I型单纯疱疹病毒（HSV）和TESSA辅助病毒生产系统为大规模生产提供了可放大的替代方案。药物诱导型稳转细胞系可能代表了下一代rAAV药物的生产平台，将大幅降低生产成本，同时提高生产稳定性。BHK：Baby Hamster Kidney，幼仓鼠肾细胞。
rAAV的下游纯化，常用的方法有氯化铯或碘克沙醇密度梯度超速离心法、亲和/离子交换层析法。此外，研究者们正在积极开发AAV生产用稳转细胞系，将病毒包装元件整合到细胞基因组中，再通过化学诱导的方法进行病毒生产。相较于传统的转染系统，稳转生产系统作为下一代rAAV生产平台，不需要多批次的质粒生产，以及转染试剂等昂贵物料，其生产成本更低，而且更容易进行大规模的放大生产。
HEK293细胞瞬时转染生产系统
传统的HEK293细胞瞬时转染生产系统，涉及将携带目的基因、AAV Rep/Cap基因和腺病毒辅助基因（VA RNA、E2A和E4OEF6）的三种质粒，以一定的比例转染HEK293细胞（另一个病毒包装必需的腺病毒辅助基因E1a/b已整合在HEK293细胞基因组中）。这种三质粒共转染系统随后被进一步优化为二质粒共转染系统，即一个携带目的基因的质粒，以及一个携带Rep/Cap和腺病毒辅助基因的质粒。
一项值得注意的最新研究表明，与标准三质粒共转染（100% GOI质粒）相比，“低GOI”三质粒共转染（1%或10% GOI质粒），可以显著减少目的基因(Gene of interest, GOI)质粒的使用量，并提高体内感染效率。更重要的是，这种方法有助于包装对rAAV产量有抑制作用的目的基因，并降低rAAV产品以及感染后组织内的质粒骨架DNA残留。另外，AAVnerGene公司开发了一种全新的一体化rAAV生产系统，称为AAVone，即将Rep/Cap、腺病毒辅助基因与目的基因整合到单一质粒中。与三质粒共转染方法相比，AAVone所需的质粒更少，rAAV产量更高，批间差异更小，复制型腺相关病毒（rcAAV）的风险更低，并且省去了三质粒配比工艺优化的工作。
瞬时转染方法因其能够方便快速地制备具有不同目的基因和衣壳蛋白的rAAV，展现了其高度的灵活性，在药物早期研发到CMC开发的衔接过程中具有很大优势，且容易实现工艺平台化，目前已经上市的AAV基因治疗药物主要是以三质粒转染体系进行生产。在感染活性方面，基于HEK293细胞的转染体系生产的AAV病毒通常感染活性更高，有利于注射剂量的降低。相较于辅助病毒生产体系和化学诱导稳定细胞株需要较长时间的早期毒株和细胞株开发，三质粒转染体系的方法灵活多变，工艺开发周期更短，不需要耗时建立和维护特定载体产品的稳定生产细胞系，这使得从载体设计到生产的周转时间更快。当使用悬浮细胞培养时，可以通过扩大培养体积来实现一定程度的放大生产，从而提高单批次产量。然而，这种方法的生产成本相对较高，转染所需的转染试剂和质粒占生产成本的很大部分，高效率低成本的转染试剂的开发将有利于瞬转体系的成本控制，同时二质粒系统、AAVone系统等可进一步缩减质粒生产批次数量，同时也可通过货架式生产的方式减少辅助质粒和常用衣壳质粒的生产，以综合降低生产成本。
杆状病毒生产系统
然而，BEVS的一个缺点是杆状病毒的遗传不稳定性。在复制过程中，杆状病毒会自然去除其基因组的一部分，产生突变病毒，其中一些可能变成有缺陷的干扰颗粒。在细胞放大培养时，这些突变体可能会与具有完整基因组的杆状病毒竞争，降低rAAV产量。通过删除特定基因或将外源基因插入杆状病毒基因组的稳定位点，可以增强杆状病毒的遗传稳定性。 此外，BEVS本身无法将衣壳蛋白VP1、VP2和VP3按比例1:1:10组装成AAV病毒颗粒，导致生产的rAAV产品感染效力低。研究发现，通过在rAAV序列中引入特定内含子，比如利用杆状病毒的多角体启动子，能够获得更高产的rAAV产品，产量可达到1.0×10^14 vg/L，这一方法适用于多种血清型。
哺乳动物稳转细胞系和Ad-AAV杂交体用于rAAV生产
用稳转细胞系进行载体生产具有明显的优势，包括易于进行产品表征分析、可放大性，以及在提高生产重现性和降低成本的同时具有更高的产量。基于Ad感染的rAAV生产体系有两种类型的稳转细胞系：包装细胞系和生产细胞系。包装细胞系稳定地整合了AAV Rep/Cap基因。使用包装细胞系进行rAAV生产的主要挑战是，细胞需要首先被AAV的天然辅助病毒——野生型Ad感染，以启动内源性Rep/Cap表达，然后通过感染Ad-AAV杂交病毒来释放、复制和包装目的基因。而相比之下，生产细胞系则将Rep/Cap和目的基因稳定地整合到宿主基因组中。在这种情况下，野生型Ad的感染将激活Rep/Cap基因表达，促进目的基因的释放、复制和包装。源于A549和HEK293细胞的稳转细胞系已经适应了悬浮培养，可用于大规模rAAV生产。
几种基于HeLa的细胞系，如C12、H44和B50，通过内源性表达Rep/Cap用于生产具有感染活性以及无rcAAV风险的高产rAAV产品。也有报道称，表达Rep/Cap的A549衍生稳转细胞系和K209细胞系也能用于生产具有感染活性的高产rAAV产品。
稳转细胞系和基于Ad感染的rAAV生产系统也存在一些不足。首先，构建稳转细胞系通常是一个复杂、耗时的过程，且构建的稳转细胞系是血清型和目的基因特异性的。其次，在传代过程中维持这些细胞系的特性和稳定性可能具有挑战性。此外，为确保基因治疗产品的安全性，必须确保下游纯化工艺能够消除任何致病性的Ad病毒残留和致癌性的HeLa DNA残留。
重组单纯疱疹病毒系统用于rAAV生产
rHSV是另一种能够为rAAV生产提供辅助功能的天然辅助病毒。为了用rHSV系统生产rAAV，需要创建两个不同的rHSV，一个携带AAV Rep/Cap基因，另一个携带目的基因，用于HEK293或BHK细胞的连续感染，然后进行下游处理和纯化。使用rAAV1治疗α1-抗胰蛋白酶缺乏症的第一个临床试验就是使用rHSV生产的。使用基于rHSV的系统进行rAAV生产时，一个显著的缺点是难以产生足够数量的rHSV颗粒，并且需要进行专门的纯化步骤来有效去除神经嗜性和神经毒性的rHSV以及其他可能与最终rAAV产品相关的污染物。
四环素诱导自沉默腺病毒系统
经典的rAAV生产方法要么需要使用质粒瞬时转染，要么需要使用辅助病毒。然而，在放大生产过程中，无辅助病毒质粒瞬转系统面临放大规模的挑战，而辅助病毒生产系统需要更强大的下游处理和纯化步骤，以消除污染性的辅助病毒和免疫原性高的病毒衣壳蛋白（VPs），以及其他与最终rAAV产品相关的污染物。最近的一项创新发明了一种改良的辅助腺病毒，通过在腺病毒的主要后期启动子（MLP）中引入一个可诱导的四环素抑制子结合位点，改良后的腺病毒能够在多西环素存在时正常复制，但在多西环素不存在时，限制了其基因组的扩增和早期基因的表达，即限制了腺病毒的复制。通过采用这种具有自我调节能力的腺病毒辅助系统，研究人员有效地实现了必需的腺病毒辅助功能、Rep/Cap基因以及目的基因的递送。过去，许多尝试在HEK293细胞中建立稳定表达AAV Rep基因的遗传稳定重组腺病毒载体都未能成功，原因在于即便在极低水平的泄漏性表达下，Rep蛋白也会显示出细胞毒性和重组活性。然而，四环素诱导自沉默腺病毒（Tetracycline-enabled self-silencing adenovirus,TESSA）系统通过严格调控Rep基因的表达，在目的基因的释放、复制和包装过程中才激活Rep基因的表达，这实现了重大的技术突破。
下一代生产平台技术
究竟选择使用哪种生产系统，往往需要综合考虑灵活性、可放大性和质量等因素，因为它们在rAAV产品开发中扮演着至关重要的角色，以满足临床应用的剂量需求、安全性、有效性。为了进一步提升瞬时转染生产系统，可以对上游病毒生产以及下游纯化过程的多个工艺参数进行持续优化，旨在增加产量和减少空壳病毒。减少空壳病毒可增强rAAV产品的效力，以降低注射剂量，从而减少免疫毒性。研究者目前正在努力优化rAAV生产的上游工艺，以提高rAAV产量，例如通过将GOI质粒降低为1%或10%以调整质粒配比，可以实现与传统三质粒转染相当的rAAV产量。这种方法使得以前无法包装的目的基因能够被包装，同时也减少了质粒骨架残留，被证明是一种提升成本效益的有效策略。
对三质粒瞬时转染生产系统的机制建模研究识别了rAAV生产中的几个关键瓶颈，包括质粒入核效率不高，以及衣壳合成和目的基因复制的时间不协调而导致空衣壳等。解决这些问题的策略方向是确保目的基因复制发生在衣壳组装之前或与之同时进行，例如早期提早Rep蛋白的表达，或晚期延迟Cap蛋白的表达。
此外，研究人员还在努力寻找可以促进rAAV生产的小分子化合物添加剂。已经成功组建了一个包含130多种小分子化合物的库，这些化合物能够迅速拮抗细胞的内在抗病毒通路，从而提高病毒产量。含有咪唑的小分子已被证明可以通过多个信号通路改善rAAV的大规模生产。
修改宿主因子也可以影响rAAV生产。通过全基因组筛选策略，研究发现有几个功能获得或功能丧失靶标可以显著影响rAAV的生产。此外，一项对瞬时质粒转染的宿主细胞的转录反应进行的系统分析，揭示了宿主细胞将rAAV生产视为一种感染性侵害，并上调炎症和抗病毒反应。
为了减少空壳病毒，一项研究构建了一个由不同AAV血清型的Rep基因与AAV2 Rep基因的3′端组合的杂交Rep基因，使得非AAV2血清型的实心病毒增加了2-4倍，这表明增强Rep功能可能会改善rAAV的生产。
工业界下游纯化工艺的优化也在去除空壳病毒方面取得了显著进展，从超速离心到基于柱层析的色谱法，以在大规模生产中有效地纯化rAAV产品。阴离子交换色谱法已成为该领域的一个主要焦点，通过修改各种工艺参数，包括pH值、各种洗脱盐、辅料、表面活性剂、稳定剂和渗透压调节剂，以提高纯化效率。
未来的生产方法应当优先考虑灵活性、可放大性和质量的最大化，同时摒弃对质粒转染、病毒感染和化学诱导的依赖。最近许多研究努力都集中在开发一种具备这些核心特性的稳转且可诱导的生产细胞系上。研究人员成功构建了一个集成了目的基因、Rep/Cap基因以及辅助编码序列的HEK293细胞系，这些序列受到多个诱导型启动子的精细调控。在适当诱导下，该细胞系能够产生具有感染性的rAAV载体。这种一体化生产细胞系允许对复制和包装活动进行独立控制，确保高质量的rAAV生产。后续研究对这一生产细胞系进行了进一步的优化，包括限制目标基因的过量表达、调整诱导表达的曲线，以及利用蛋白酶体抑制剂减少衣壳蛋白经蛋白酶体途径的降解，从而提升了细胞系的生产效率。对于大规模载体生产，已经开发了另一个两步法平台，用于构建稳定和可诱导的生产细胞系。首先，研究人员在悬浮培养条件下，利用特有的CAP人类细胞系或HEK293细胞，通过稳定整合Rep和辅助基因，构建了α细胞系。然后，他们将Cap基因和目标基因加入其中，形成了一个多克隆生产细胞池，通过单细胞克隆技术、克隆筛选以及挑选获得表现最佳的克隆。在这一体系中，rAAV的生产依赖于多西环素的诱导。在一项关于此生产细胞系的概念验证研究中，采用灌流培养生产rAAV8-GFP，使得每个细胞的rAAV产量提升了8倍，与常规批培养工艺相比，实心病毒的产量也有了显著的提高（30-40%）。
提高载体基因组的完整性是另一种提高rAAV产品效力的策略。一项采用长读长测序技术和生物信息学分析方法的研究，在scAAV制剂中发现多种不同的载体基因组类群。研究结果表明，载体基因组设计中固有的稳定DNA二级结构可能导致显著的基因组截断，进而影响rAAV的生产效率和载体的效力。另一组研究发现了存在的基因组截断形式，以及一种特殊的基因组变体，这种变体来源于一个可被切割的ITR及一小部分目的基因序列和一个与质粒骨架相连的嵌合序列。在设计携带尾对尾结构的双sgRNA表达盒的载体基因组时，也观察到了这种异质性。值得注意的是，研究团队发现人类细胞与昆虫细胞生产的rAAV在基因组的异质性上表现出了明显的差异。这些发现提示我们，必须重视载体基因组的设计以及产品异质性，这对于高效生产用于临床的rAAV产品尤为关键。