近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。温故而知新，前几章我们分别学习了AAV的基础知识、AAV的载体开发、AAV的生产工艺，相信大家都有不少收获，下面我们继续学习关于AAV的临床应用。
rAAV基因治疗临床试验概述
在过去的几十年里，重组腺相关病毒（rAAV）在临床应用方面取得了显著的进展，显示出其在治疗多种遗传性和后天性疾病方面的巨大潜力。自美国食品药品监督管理局（FDA）批准Luxturna以来，短短几年内市场上又新增了六种rAAV基因治疗产品（详见https://mp.weixin.qq.com/s/Mq5rG5elbmwp-vch616oYw）。
尽管基于rAAV的疗法在一些临床试验中取得了令人瞩目的成果，但仍有许多问题需要进一步研究，如载体的免疫原性、剂量优化和长期安全性等。对于大多数单基因疾病而言，rAAV的高产量生产可能不是当前的首要挑战，但随着越来越多的rAAV基因治疗药物被开发用于治疗常见的慢性疾病，大规模生产rAAV可能会成为一个瓶颈。此外，基因治疗的监管框架正在快速变化。在本文中，我们将重点讨论rAAV在主要人类疾病中的最新临床应用进展（图1），包括眼科疾病、神经系统疾病、代谢疾病、血液疾病、神经肌肉疾病、心血管疾病以及肿瘤。
图1 rAAV在人类重大疾病中的临床应用。rAAV的临床应用涵盖了眼科、神经学、代谢、血液学、神经肌肉、心血管疾病以及肿瘤等多个领域。
眼科疾病
眼科疾病已成为rAAV基因治疗研究的热点领域，这主要归因于以下几个关键因素：
- 眼睛具有免疫豁免特性，能够降低对rAAV的免疫反应。
- 眼睛体积较小，所需的rAAV剂量相对较少。
- 许多眼科疾病由单基因突变引起，使其成为基因治疗的理想对象。
- 眼睛易于接触，使得rAAV可以通过多种给药途径进行治疗。
在这里，我们将重点介绍几种基于rAAV的眼科基因治疗药物，特别关注单基因和后天性眼科疾病的治疗最新进展。
结果显示，接受Luxturna治疗的患者组在一年内的平均功能性视力显著优于对照组（平均1.8光照水平vs 0.2光照水平）。此外，全视野敏感度阈值测试（FST）显示，治疗组在第30天的改善超过100倍，并且这种改善在后续的3-4年随访研究中得以持续。基于III期试验中的积极结果，Luxturna在2017年获得了FDA的批准，用于治疗与RPE65双等位基因缺陷相关的视网膜疾病，成为首个获批用于治疗遗传性眼科疾病的基因疗法。
视网膜色素变性GTP酶调节蛋白（RPGR）基因突变是导致X连锁视网膜色素变性（XLRP）的常见原因，主要影响男性，被认为是视网膜色素变性中最严重的形式之一。XLRP的特点是光感受器和视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍，导致进行性视力丧失。针对RPGR基因突变的患者，已经开展了三项临床试验，以评估基于rAAV的基因治疗的安全性和有效性。其中一项试验的初步结果令人鼓舞，部分患者在治疗后视力功能有所改善，视网膜结构也显示出稳定性。对于XLRP的基因治疗临床试验（XIRIUS）和自然病史研究（XOLARIS）的事后分析显示，接受最高剂量的cotretigene toliparvovec（BIIB112/rAAV8-RPGR）治疗的四名患者在第12个月时视网膜敏感性和低亮度视力有所改善。然而，在另一项II/III期研究中，这种基因治疗并未达到眼科疾病治疗中光敏感度显著改善这一主要终点。
大约15%的视网膜色素变性（RP）患者是由于视紫红质（RHO）基因的常染色体显性功能获得性突变所引起的。针对这类突变，可以通过基因沉默或敲除进行治疗。在非人灵长类动物（NHPs）中进行的临床前研究中，使用了一种名为EDIT-103的研究性基因疗法。该疗法包含两个rAAV5载体，利用CRISPR/Cas9技术敲除内源RHO基因，并插入一个经过密码子优化的RHO表达盒。该表达盒能够抵抗Cas9的切割，从而恢复功能性RHO基因的表达。初步研究结果显示，RHO基因的表达和视觉功能均得到改善。然而，EDIT-103在人类患者中的疗效还需要进一步的评估。
除了基因替代或基因编辑方法，科学家们还探索了其他创新的治疗视网膜色素变性（RP）的策略，比如光遗传学。光遗传学是一种利用光来控制基因修饰细胞中光敏蛋白的技术。在一项IIb期临床试验中，通过玻璃体内注射，研究人员初步评估了MCO-010（一种在rAAV2载体中编码的多特征视蛋白，专门针对ON视网膜双极细胞）治疗RP患者的疗效。MCO-010旨在通过恢复视网膜的感光功能来改善视力，而这一过程不依赖于遗传突变。早期的临床试验结果显示，MCO-010能够改善患者的视力，并且在治疗过程中没有出现严重的眼部或系统性不良事件。这表明光遗传学可能为RP患者提供了一种新的治疗选择。
GT005是由Gyroscope公司开发的一种基于rAAV2的一次性基因疗法，通过视网膜下注射用于治疗由年龄相关性黄斑变性（AMD）引起的地理性萎缩。该疗法旨在通过增加补体因子I（CFI）蛋白的表达，减缓老年视网膜中过度活跃的补体系统引发的视网膜退化。这是一种基因添加策略，目的是减少炎症，延缓视网膜细胞退化。EXPLORE和HORIZON是两项II期、多中心、随机对照试验，用于评估GT005在两类地理性萎缩患者中的安全性和有效性。EXPLORE试验针对的是CFI基因变异导致CFI蛋白表达低下的AMD地理性萎缩患者，而HORIZON试验则针对仅由AMD引起的地理性萎缩患者。中期数据显示，GT005治疗能够持续提高玻璃体中的CFI水平，减少CFI下游蛋白，且治疗效果局限于眼部，未观察到CFI水平的系统性增加。然而，Gyroscope公司近期决定停止GT005的进一步开发，因为该疗法在临床试验中已达到无效标准。
sFlt-1是一种嵌合的VEGF抑制蛋白，由Flt-1（VEGF受体-1）的第2结构域与人类免疫球蛋白G1的重链Fc片段结合而成。在针对新生血管性AMD的基因治疗研究中，采用编码sFlt-1的rAAV2载体，并通过玻璃体内注射和视网膜下注射的方式进行了探索。在I期临床试验中，通过玻璃体内注射的rAAV2-sFlt-1被证实安全且耐受性良好，尽管个体之间的sFlt-1表达水平和治疗效果存在差异。同样的载体通过视网膜下注射在老年患者中也表现出良好的耐受性。然而，尽管视力改善并非试验的主要研究终点，但在试验中未观察到明显的视力提升。
RGX-314是Regenxbio公司开发的一种针对新生血管性AMD的治疗方法，给药方式为视网膜下注射，该疗法使用的是编码抗VEGF单克隆抗体片段的rAAV8载体，与兰尼单抗（Ranibizumab）的作用机制类似。I期临床试验（ASCENT）初步结果显示，RGX-314具有良好的安全性和耐受性，且治疗效果与剂量呈正相关。部分患者在接受治疗后，最长可达18个月内无需额外的抗VEGF注射。
ADVM-022是Adverum Biotechnologies公司开发的一种基因治疗产品，它利用从rAAV2衍生的工程化7m8载体来编码aflibercept，用于治疗新生血管性AMD。在I期临床试验（OPTIC）中，通过单次玻璃体内注射ADVM-022，在长达92周的随访期间，超过80%的患者减少了对额外抗VEGF注射的需求。
神经系统疾病
神经系统疾病是当前基因治疗研究的重要方向。目前，FDA已批准的针对神经系统疾病的rAAV基因治疗方法主要有两种递送途径：一种是通过立体定向递送，将rAAV精确注入特定解剖位置，以实现局部的基因表达；另一种是通过静脉注射（i.v.）方式进行递送，从而实现广泛的中枢神经系统转导。
患者通常在生命早期就会出现肌张力减退、肌张力障碍、眼球运动危象、发育迟缓以及自主神经功能障碍等症状。从症状初次发作（约2.7个月大）到确诊（约3.5岁）之间，往往存在较长的延迟期。在严重情况下，患者可能错过所有发育里程碑，无法控制头部，无法学会站立或坐下，甚至可能在10岁前去世。
帕金森病（PD）和AADCD虽然病因不同，但两者的治疗目标都是提高纹状体中的多巴胺水平。这一共同目标促使人们产生了使用同一种治疗载体来治疗两种疾病的想法。2008年，研究人员首次尝试通过立体定位手术将表达AADC的rAAV（rAAV.AADC）递送至帕金森病患者的内侧豆状核（纹状体的一部分），总体结果显示该疗法耐受性良好，为立体定位颅内递送rAAV.AADC的安全性和可行性提供了关键数据。在帕金森病试验成功的启发下，2012年，这种方法被进一步应用于台湾的AADCD患儿。四名儿童接受了双侧豆状核内注射rAAV2.AADC治疗，所有患者的运动评分均有所改善，并报告了情绪稳定性的提升。有趣的是，患者在注射后还经历了短暂的不自主运动。
一项针对10名患者的后续I/II期试验中，使用了略高的剂量（1.81 × 10^11 vg），其中年龄最大的患者在接受治疗时为8岁，且未使用免疫抑制剂。结果显示，所有患者均达到了临床运动功能改善和脑脊液（CSF）生化改善的主要终点。其他测量方法，如正电子发射断层扫描（PET）成像，显示AADC活性显著增加。同时，也观察到与输注相关的短暂性运动障碍。
2019年，日本一个研究团队在I/II期试验中采用相同的方法，并使用类似的载体和剂量（2 × 10^11 vg）对六名患者进行了治疗。与以往相比，该患者群体在基因突变类型和治疗年龄上更加多样化，年龄最大的一位患者为19岁。与2017年台湾的研究相似，患者在注射后出现了短暂的口腔和四肢不协调运动。令人鼓舞的是，所有患者的运动表现和口腔进食能力均有所改善。
解剖学靶点的选择是基于帕金森病中多巴胺能神经元丧失的病理特征。然而，在AADCD患者中，多巴胺缺乏的多巴胺能神经元似乎依然存在。最近的一项安全性和有效性试验评估了针对这些位于黑质和腹侧被盖区的多巴胺能神经元的治疗方法，以模仿正常的多巴胺合成过程。七名年龄在4至9岁之间的患者被分配至两个剂量组（总剂量分别为8.3 × 10^11和2.6 × 10^12 vg）。所有患者的运动功能和情绪均有所改善，其中6名患者的眼球运动危象完全消失。这种临床改善与PET成像结果一致，表明AADC酶活性得到了提升。与大多数试验结果类似，注射后患者出现了短暂的不自主运动。然而，当前阶段很难直接比较这两种治疗方法，仍需进一步研究。
最近，台湾试验的长期随访结果报告显示，26名患者的运动功能显著改善，其中有三名患者能够行走。有趣的是，治疗年龄与运动评分呈负相关，但剂量与评分无显著关联。最常见的治疗相关不良事件（TEAE）为发热和不自主运动。除了一名患者外，所有患者的不自主运动症状均已缓解。值得注意的是，不自主运动的严重程度和持续时间与治疗年龄呈正相关，这一观察可能是理解年龄在风险与收益中的关键因素，也可能在其他中枢神经系统疾病中存在类似现象。这种疗法（Eladocagene Exuparvovec）最终获得了批准，且最近已被欧洲药品管理局认可用于18个月以上的患者（商品名Upstaza）。
SMA I型的首批临床试验结果于2017年公布。在这项研究中，15名患者接受了静脉注射的rAAV9表达SMN1（rAAV.SMN1）基因疗法，剂量为6.7 × 10^13 vg/kg或2 × 10^14 vg/kg，由CB启动子控制，并带有CMV增强子。低剂量组患者的平均年龄为6.3个月，高剂量组为3.4个月。主要结果显示，患者对呼吸机支持的需求减少，运动评分有所提升。高剂量组中，11名患者中有12人能够在几秒钟内独立坐起，并且获得了语言能力。尽管该疗法具有良好的耐受性，但常见的不良反应是肝转氨酶升高，使用皮质类固醇后此反应有所缓解。
在美国（STR1VE）和欧盟（STR1VE-EU）进行的两项III期后续研究中，分别有22名和33名患者入组，并接受了1.1 × 10^14 vg/kg的静脉注射。这两项研究的平均治疗年龄相似（分别为3.7个月和4.1个月）。美国研究的主要终点包括独立坐起至少30秒和无需呼吸机支持的生存，而欧盟研究则将独立坐起至少10秒作为主要终点，将无需呼吸机支持的生存率作为次要终点。这两项研究都采用了泼尼松龙方案。在STR1VE研究中，22名患者中有13名能够独立坐起至少30秒；在STR1VE-EU研究中，33名患者中有14名能够独立坐起至少10秒，其中一名患者达到了30秒。值得注意的是，欧盟试验的纳入标准更为宽松，其中一些患者表现出更晚期的疾病症状，这限制了两项研究的直接对比。此外，这两项试验均报告了注射后肝转氨酶升高和血小板减少的情况。
2021年公布的START试验长期随访结果显示，经过最长6.2年的跟踪，患者维持了在初始试验期间获得的运动技能。更令人鼓舞的是，有两名患者达到了新的运动发展里程碑，并能在辅助下站立。在安全性方面，结果依然非常乐观，没有报告与治疗相关的不良效应（TEAEs）
随着获批疗法的普及，现在可以将脊髓性肌萎缩症（SMA）纳入新生儿筛查项目中，这有助于识别那些尚未表现出症状的患者。这种早期识别提高了进行预防性治疗的可能性，从而有望在症状出现之前就对疾病进行干预和管理。
SPR1NT试验评估了Onasemnogene abeparvovec（Zolgensma）用于预防性治疗的疗效，治疗剂量为1.1 × 10^14 vg/kg。研究对象包括14名携带两个SMN2基因副本的患者（中位年龄21天）和15名携带三个SMN2基因拷贝的患者（中位年龄32天）。所有患者均接受了预防性泼尼松龙治疗和后续监测。在携带两个SMN2基因拷贝的患者中，所有人都达到了独立坐起超过30秒的主要终点，其中11/14的患者在正常发育窗口内达到了这一里程碑，独立站立的结果也类似。就独立行走而言，考虑到对行走定义的差异，9-10/14的儿童能够独立行走，其中4-5名在预期的发育窗口内实现了这一点。值得一提的是，研究结束时所有患者均存活且无需长期呼吸支持。常见不良事件包括转氨酶升高、心脏血清标志物升高、血小板减少，但未出现血栓性微血管病（TMA），以及短暂的无反射/低反射现象，所有的不良反应在除一名患者外的所有患者中均已缓解，这些反应被归为与治疗无关。
携带三个SMN2基因副本的患者通常表现出较轻的病情，这一点在14名患者中有15名至少能独立站立3秒和至少走五步中得到了体现。在这些患者中，有14名在预期的发育窗口内能够站立，11名能够行走。与携带两个SMN2基因副本的患者相似，所有携带三个SMN2基因副本的患者在研究结束时都存活且无需永久性呼吸支持。报告的治疗相关不良效应（TEAE）与携带两个SMN2基因副本的患者组相似。
这两个患者群体的研究成果强调了早期预防性治疗的重要性，这种治疗能够带来以前使用Zolgensma未曾观察到的临床改善程度。这些结果也显示了治疗的高安全性，尽管有更严重肝毒性甚至死亡的个案报告。Zolgensma于2019年获得FDA批准，截至2023年3月20日，根据诺华公司的数据，已有超过3000名患者接受了Zolgensma治疗。已完成或正在进行的研究目前正在探索新的治疗方面，包括联合疗法或将患者从传统疗法转移到Zolgensma。
代谢性疾病
代谢性疾病是由遗传缺陷引起的一类疾病，这些缺陷可能导致全身性或器官特异性的代谢紊乱，进而影响治疗方案的设计和药物的给药途径（例如，主要表现为中枢神经系统病变的溶酶体贮积病）。在这里，我们将以泰萨克斯病（Tay-Sachs disease，简称TSD）、桑霍夫病（Sandhoff disease，简称SD）和卡纳万病（Canavan disease，简称CD）为例，它们是当前正在进行的神经代谢性疾病的临床试验的研究对象，相关的临床试验编号包括NCT04669535、NCT04798235、NCT04833907和NCT04998396。
TSD和SD是属于溶酶体贮积病的GM2神经节苷脂沉积症，由常染色体隐性的功能丧失突变引起，这些突变发生在编码广泛表达的β-N-乙酰己糖胺苷酶（HEX）的基因中。HEX由α和β（HEXA）、β和β（HEXB）或α和α（HEXS）亚基组成的二聚体。TSD和SD分别是由编码α亚基和β亚基的基因突变引起的。在临床表现上，这两种疾病可分为婴儿型、青少年型和成人型，不同类型在发病时间和严重程度上有所差异。
在治疗代谢性疾病时，确保α和β亚基之间的化学计量平衡对于实现HEX二聚体的最佳功能至关重要。由于rAAV载体的包装能力有限，研究者采取了两种策略来解决这一问题。一种方法是使用两个独立的载体同时递送α-和β-亚基，以保证两者的比例平衡。另一种方法是开发了一种双顺反子rAAV载体，这种载体能够共同表达α-和β-亚基，从而简化了治疗过程。这两种策略都是为了优化治疗效果，确保酶活性最大化，同时减少副作用的风险。
2022年，一项针对两名TSD患者的扩展使用试验验证了鞘内（i.t.）注射两种表达α和β亚基的rAAV.rh8载体的安全性。这两名患者年龄分别为30个月（1.0 × 10^14 vg；鞘内注射）和7个月（4.05 × 10^13 vg；双侧内脑室与鞘内联合注射），并接受了利妥昔单抗、西罗莫司和泼尼松龙的免疫抑制治疗。结果显示，该方案和载体具有良好的耐受性。尽管功能改善不是此次研究的主要终点，但两名患者均表现出疾病稳定的迹象。这是首次在人类中进行TSD rAAV基因治疗的重要尝试，也是评估内脑室输注疗法的关键里程碑，并为正在进行的临床试验铺平了道路。
目前，加拿大（NCT04798235）和美国（NCT04669535）正在进行两项针对TSD的临床试验。加拿大的I/II期试验使用rAAV9，通过单次鞘内给药，将HEXA和HEXB转基因递送至婴儿型TSD或SD患者。相比之下，美国的试验设计为剂量递增研究，通过双侧内脑室途径和鞘内/脑池联合给药方式，探索四种不同的载体剂量。该研究使用两个rAAV.rh8载体分别递送HEXA或HEXB转基因。这些试验的结果尚未公布。
卡纳万病（CD）是一种常染色体隐性遗传的进行性神经退行性疾病，其特征是脑组织的海绵状变性和N-乙酰天门冬氨酸（NAA）水平的升高。这种疾病由ASPA酶的功能丧失性突变引起，导致NAA在中枢神经系统和尿液中积累。患儿通常无法学会走路、说话、控制头部运动，或达到任何程度的独立性，且许多患儿在生命的最初几年内就会因该疾病去世。在治疗方面，一项临床试验首次评估了通过颅内rAAV给药治疗CD的安全性。在这次临床试验之后，载体设计优化的研究结果显示，在小鼠模型中可以根据年龄实现不同程度的疾病预防和逆转，表明不同的载体设计和给药途径可能会影响临床前研究的结果。
在早期的单一患者试验中，采用了脑室内（i.c.v.）和静脉内（i.v.）给药途径相结合的方式，以减少总体载体剂量。然而，为了评估这种策略的有效性，需要进行进一步的比较研究。
目前，有两项针对卡纳万病的临床试验正在进行中，试验编号分别为NCT04833907和NCT04998396。这两项试验采用了不同的载体设计和给药方式，一种是颅内注射，另一种是静脉注射。由于给药方式的不同，所需的剂量也有所差异。两项试验的初步数据显示出积极的治疗效果。但由于这两项试验都还在进行中，目前还无法进行直接的效果比较。
血液疾病
非肿瘤性血液病可以分为细胞性疾病和非细胞性疾病两大类。细胞性疾病是指遗传突变影响细胞功能，如镰状细胞病；非细胞性疾病则影响血液成分，如血友病。这种分类对于基因治疗来说非常重要，因为它决定了治疗的目标细胞或器官。
在细胞性血液病中，治疗靶点通常是细胞性血液成分，如骨髓中的造血干细胞和祖细胞（hematopoietic stem cell and progenitor cell, HSPC）。这些细胞是血细胞的前体，包括红细胞、白细胞和血小板等，它们在骨髓中生成并参与血液循环。在治疗细胞性血液病时，这些造血细胞及其前体细胞是重要的治疗靶点，因为它们与疾病的发生和发展密切相关。然而，由于血细胞的半衰期较短，直接使用rAAV对其进行治疗效果有限，因为细胞会不断更新，导致治疗效果快速消失。与此同时，骨髓干细胞能够持续分裂生成新细胞，但这也会稀释rAAV基因组的效果。但如果能够编辑宿主基因组，或者基因治疗的细胞获得生长优势，那么这将是一个理想的治疗效果。与此相对，非细胞性血液病涉及的是非细胞成分，这些成分是由细胞释放到血液中的，例如血友病。这为我们提供了一个机会，即可以在任何能够将蛋白质分泌到血液中的细胞类型中表达转基因，从而治疗疾病。
血友病A和B是两种典型的非肿瘤性血液病，它们都是由于血液中缺乏特定的凝血因子而引起的遗传性疾病。血友病A是由于凝血因子VIII（FVIII）缺乏引起的，而血友病B则是由于凝血因子IX（FIX）缺乏引起的，这两种疾病都是隐性X连锁遗传。据估计，血友病A的患病率大约为每10万人中有12例，而血友病B的患病率约为每10万人中有4例。FVIII主要在内皮细胞中合成，而FIX则主要在肝细胞中产生。
血友病A和B是两种常见的遗传性出血性疾病，它们都会导致患者有较高的自发出血或轻微创伤后出血的风险，这可能会导致严重的健康问题，如颅内出血等。此外，由于反复出血，患者可能会出现局部组织反应和致残性细胞退化，例如血友病性关节病。值得注意的是，与普通人群相比，血友病患者的总体生存率降低。
在基因治疗出现之前，治疗重度血友病A或B需要反复补充缺乏的凝血因子或使用药物调节凝血级联反应。随着医疗费用的不断上涨，至2019年，美国用于血友病治疗的支出已达约15亿美元。基因治疗因其潜在的持久效果和丰富的临床知识（包括血友病的自然病史）而成为理想的治疗方式，这在基因治疗的发展中尤为关键，通常超罕见疾病中缺乏类似的知识基础。此外，由于FVIII和FIX是分泌性蛋白，这意味着可以通过在其它组织（如肌肉）中的异位表达来产生这些凝血因子。血友病的严重程度是根据血浆中FVIII或FIX活性来分类的：严重型活性小于1%，中等型活性在1-5%之间，正常型活性在5-40%之间。这为实现部分（大于1%）或完全（大于5%）疾病矫正提供了清晰的目标水平。在许多其他疾病中，类似的临床显著阈值较为少见或尚未明确。
在rAAV取得成功之前，使用病毒载体开发血友病基因治疗的尝试已有开展。然而，这些早期的非rAAV研究未能实现持久的治疗因子水平，或引发了针对病毒载体的免疫反应。1997年，两项研究分别通过肌肉内（i.m.）和肝门静脉注射（用于靶向肝脏）rAAV.hFIX，成功实现了持久的人类FIX（hFIX）表达。
FIX活性抑制抗体的出现可能是一个挑战，这些抗体在肌肉内注射rAAV.hFIX后被发现。然而，使用物种特异性的转基因可能会减少抗体或其他免疫反应的发生，例如在血友病B犬的研究中使用犬FIX（cFIX）时所展示的。尽管肝门静脉注射是一种侵入性方法，并且犬在注射rAAV.cFIX前需要补充FIX，但与肌肉内注射相比，血浆中的cFIX水平略有提高。然而，由于研究参数（如载体剂量）的差异，这一结论并不完全可靠。
2000年，一项I期临床试验通过肌肉内递送rAAV.hFIX治疗血友病，结果显示了良好的安全性，且三年后的研究结果确认了这一点。值得注意的是，试验中未检测到针对FIX的抑制性或非抑制性抗体，这可能与患者选择（只有错义突变的患者）和限制每个部位的总rAAV剂量有关，后者在动物模型中被认为与抑制性抗FIX抗体的形成相关。然而，患者的FIX血清水平仍低于1%，未达到最低治疗目标。另一项I/II期试验通过肝动脉递送rAAV2.hFIX，仅实现了短暂的FIX表达，可能是由于抗-AAV衣壳细胞免疫反应导致肝细胞破坏和转基因丢失。这一发现引发了对rAAV免疫学及其对临床安全性和有效性影响的高度关注。为提高治疗效果，研究人员随后通过优化多项参数（如采用新型rAAV衣壳、转基因密码子优化、选择合适的启动子、改进给药途径和使用免疫抑制）来提升FIX表达。2009年，具有超生理活性的FIX Padua变体的发现也带来了创新。随后的一项I期试验使用亲肝性的rAAV8和密码子优化的hFIX转基因，通过静脉注射递送，实现了2-12%的FIX活性，且未使用免疫抑制。正如预期的那样，观察到了体液和T细胞介导的抗-AAV8衣壳免疫反应，尽管T细胞反应通常与剂量相关，但并非在所有患者中都出现，表明可能存在患者特异性因素。该试验的患者随后被纳入一项随访研究，另有四名新患者加入并接受了高剂量组治疗。结果显示，平均随访3.2年期间，FIX活性维持在1-6%。尽管安全性良好，但高剂量组中部分患者在未使用免疫抑制的情况下出现了FIX活性下降并伴随转氨酶水平延迟升高的问题，通过糖皮质激素治疗后得到缓解。
尽管对rAAV8衣壳的改造和转基因的密码子优化显示出积极效果，但这些改进并没有始终如一地实现治疗性FIX活性。为了克服这些挑战，研究者设计了一种新的工程化衣壳，它具有更强的肝脏靶向性，并结合了密码子优化的Padua FIX变体。值得注意的是，这次试验的剂量（5.0 × 10^11 vg/kg）比2011年和2014年试验的高剂量（2.0 × 10^12 vg/kg）低了四倍。即便剂量减少，FIX活性仍达到平均33.7%（范围为14-81%）。试验中未使用预防性免疫抑制，只有两名患者因短暂的转氨酶升高接受了泼尼松龙治疗，显示出优异的安全性。临床上，年出血率从平均11.1显著下降至0.4。总体而言，Padua变体的高活性被证明非常有益，已在后续临床试验中广泛应用。
血友病B的临床试验揭示了人类rAAV基因治疗的一些此前未预见的因素，包括转基因表达逐渐减少和免疫反应等方面。目前，FDA已批准了血友病B基因治疗（静脉注射rAAV5 Padua，商品名Hemgenix，Etranacogene dezaparvovec），并已上市。而其他rAAV产品，如使用rAAVS3衣壳的verbrinacogene setparvovec（FLT180a）和Fidanacogene elaparvovec（之前称为SPK-9001和PF-06838435）也在进行临床试验，正在等待FDA的批准。
血友病A的一个主要挑战在于FVIII转基因的大小约为7 kb，超过了rAAV的包装容量，因此需要使用截短版本。为评估截短FVIII的治疗效果，研究通过静脉注射rAAV5递送经过密码子优化的FVIII变体（FVIIISQ，即缺失B域的FVIII）。不同剂量组（6.0 × 10^12、2.0 × 10^13和6.0 × 10^13 vg/kg）的试验结果显示，最高剂量组在52周的研究期间内能实现治疗性FVIII活性。令人鼓舞的是，只有高剂量组的患者接受了免疫抑制，且未发现任何临床不良反应。然而，随时间推移，转基因表达呈下降趋势。
在血友病A基因治疗的研究中，一项试验评估了使用rAAV3衍生衣壳的效果，该衣壳在18名患者中以四种不同剂量（5.0 × 10^11至2.0 × 10^12 vg/kg）表达FVIIISQ。尽管这种治疗显示出一定的疗效，但在18名患者中，有2人由于对rAAV衣壳产生免疫反应，完全失去了转基因表达，即使采用糖皮质激素治疗也未能有效控制这种免疫反应。值得注意的是，在尝试让部分患者停用糖皮质激素后，出现了细胞免疫反应。虽然Savita等人和George等人试验中所用载体特性的差异可能解释了转基因表达的稳定性差异，但也有假设认为高水平表达可能触发未折叠蛋白反应，从而导致FVIII的丢失。
在后续的III期临床试验中，134名患者通过静脉注射接受了单次6.0 × 10^13 vg/kg剂量的rAAV5hFVIIISQ。这种一次性治疗显著提高了FVIII活性，并减少了对外源性FVIII的依赖，与常规预防性使用外源性FVIII相比，年出血事件也得到改善。在中位8周时，部分患者出现转氨酶升高，96.2%的患者通过糖皮质激素治疗得以降低转氨酶水平。两年随访数据显示，年出血率和外源性FVIII使用量减少，与I/II期临床试验中的趋势相似。然而，随着时间的推移，转基因表达有所下降。出乎意料的是，III期临床试验中FVIII水平在一年和两年随访时低于I/II期临床试验的结果。这款治疗载体（商品名Roctavian，Valoctocogene Roxaparvovec，rAAV5hFVIIISQ）已获得FDA批准，目前正在开展随访临床研究，以进一步评估其长期持久性。
神经肌肉疾病
神经肌肉疾病包括影响神经元和肌肉细胞的病症，其中肌肉营养不良主要影响肌肉细胞。杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的肌营养不良类型，FDA最近已批准了一种基于rAAV的基因疗法用于治疗DMD。DMD是一种罕见的X连锁进行性疾病，患病率约为每10万人中15.9到19.5例，主要影响男性，但也有罕见的女性病例。DMD由肌营养不良蛋白基因突变引起，导致肌营养不良蛋白缺失或功能失常，表现为肌肉无力、失去行走能力、呼吸功能障碍和心肌病，后两者通常是致死原因。
肌营养不良蛋白基因包含八个启动子和79个外显子，生成约11.4 kb的cDNA和427 kDa的肌肉同型蛋白。突变通常导致患者产生截短蛋白。由于肌营养不良蛋白cDNA的体积超出rAAV的包装容量，基于rAAV的基因替代疗法面临挑战，因此目前的研究集中在识别所需的最小蛋白质序列。已开发出两种肌营养不良蛋白转基因：约6-8 kb的迷你肌营养不良蛋白和约4 kb的微肌营养不良蛋白。迷你肌营养不良蛋白需要分割并通过两个rAAV递送，而微肌营养不良蛋白可以适配单个rAAV。其他基于rAAV的策略还包括外显子跳跃、GALGT2递送（已在小鼠模型中显示可预防肌肉病理），以及通过CRISPR技术基因编辑纠正肌营养不良蛋白基因或激活非肌肉肌营养不良蛋白的同型蛋白。这里重点介绍了已应用于人类治疗的策略。
2006年，一项临床试验评估了一种hybrid rAAV2.5载体表达的迷你肌营养不良蛋白的效果，采用肌肉内注射方式对六名5至11岁的患者进行了治疗。患者被分为两个剂量组：2 × 10^10 vg/kg和1.0 × 10^11 vg/kg。尽管在治疗后第42天，在2/6的患者中观察到部分肌纤维呈现迷你肌营养不良蛋白阳性，但在后续时间点未能检测到迷你肌营养不良蛋白阳性肌纤维，这可能是由免疫反应介导的现象。转基因特异性T细胞的发现也支持了这一点。值得注意的是，在接受基因治疗前，2/6的患者对迷你肌营养不良蛋白基因的某一区域已呈现阳性反应，这表明突变的内源性肌营养不良蛋白可能不足以诱导免疫耐受。
为实现全身受影响肌细胞的广泛靶向，一项临床试验评估了静脉内注射2.0 × 10^14 vg/kg的rAAV.rh74.micro-dystrophin在四名平均年龄为4.8岁的患者中的安全性和疗效。令人鼓舞的是，在这项I/II期试验中，所有患者的临床和组织病理学表现均有所改善，效果与治疗时的年龄和疾病严重程度相关。与2010年早期试验结果相比，此次试验未检测到针对微肌营养不良蛋白的T细胞活性。注射rAAV后，患者转氨酶水平有所升高，但反应较温和，并在接受皮质类固醇治疗后恢复正常，未发现血栓性微血管病（TMA）的迹象。此外，一项随机、双盲、安慰剂对照的临床试验（NCT03769116，delandistrogene moxeparvovec）已完成，共涉及41名患者。值得注意的是，该疗法已于2023年获得FDA批准。
除了基因替代疗法，另一种治疗策略是利用疾病修饰基因。2022年，首个使用rAAV.rh47的临床试验在两名患者（年龄分别为6.9岁和8.9岁）中展开。试验采用双侧股静脉隔离肢体灌注，每条腿分别注入5.0 × 10^13和2.5 × 10^13 vg/kg剂量的rAAV.rh47，用于表达GALGT2基因。隔离肢体灌注在动物实验中已被广泛研究，以增加肌肉转导效率，同时减少全身总剂量。GALGT2是一种β1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶，通过糖基化肌肉中的α-肌聚糖，已显示出对肌肉病理的积极作用。虽然在试验中检测到针对rAAV衣壳的抗体以及轻微的rAAV和GALGT2蛋白特异性T细胞活性，但未报告相关的肝毒性。尽管样本量过小，难以得出显著结论，但值得注意的是，接受较高剂量的年轻患者显示出更显著的改善。
其他正在进行的试验尚未完成，暂时不再招募新患者，包括Solid Bioscience的随机I/II期试验（NCT03368742）和辉瑞的非随机Ib期试验（NCT03362502）。这两项试验均使用rAAV9在肌肉特异性启动子的控制下表达截短的肌营养不良蛋白，这些试验旨在评估通过静脉内递增剂量的安全性和疗效，研究对象包括儿童和青少年，但排除了心脏和呼吸功能严重受损的患者。
制定临床试验的入排标准确实是一个挑战，这凸显了我们对于rAAV基因治疗与疾病相互作用的理解尚存在不足。最近，一项使用静脉注射rAAV9的单患者DMD试验以患者死亡告终，该试验在剂量1.0 × 10^14 vg/kg下表达与VP64连接的dCas9，以激活皮质肌营养不良蛋白的表达。患者在接受治疗时已无法行走，且病情处于晚期。在给药后的第五天，患者心脏功能恶化，第六天出现急性呼吸窘迫综合征，最终在第八天因心肺骤停去世。最终评估假设，患者可能发生了细胞因子介导的毛细血管渗漏综合征，因为针对rAAV衣壳或转基因的体液或细胞免疫反应测试结果为阴性，也未发现TMA的迹象，这是高剂量DMD试验中曾观察到的现象。另一位患者，参与辉瑞试验（NCT03362502），在接受2.0 × 10^14 vg/kg的rAAV9治疗后六天去世。该患者年龄较小，接受的剂量是前述单患者试验的两倍。虽然未进行尸检，但目前假设集中于由心脏肌肉引发的先天免疫反应导致的心力衰竭（HF）。
心血管疾病
心力衰竭（HF）是一种由心室充盈或排空的结构或功能异常引起的综合征，在美国大约影响600万人，十分常见。钙在心脏功能中起着关键作用，也是传统药物开发的主要靶点之一。临床前研究表明，一种有效策略是过度表达肌浆/内质网钙转运ATP酶2（SERCA2a），该酶在心脏舒张期将钙泵入肌浆网（SR），从而改善心脏功能。
CUPID试验评估了使用rAAV1过度表达SERCA2a（rAAV1.SERCA2a）的效果。该试验分为I/II期，其中I期为开放标签的剂量递增研究，II期为随机、双盲、安慰剂对照的研究。在I期研究中，采用单次冠状动脉内给药方式进行rAAV1.SERCA2a的心脏定向递送，剂量分别为1.4 × 10^11、6.0 × 10^11和3.0 × 10^13 vg（每剂量组3名患者）。所有接受治疗的患者在治疗时均处于纽约心脏病协会（NYHA）III级心力衰竭状态。部分患者症状有所改善，且整体上对治疗耐受良好。一名患者在试验期间死亡，但被认定与治疗无关。总体上，良好的安全性支持了II期研究的开展。在II期研究中，共招募了25名接受治疗的患者和14名安慰剂组患者，剂量分配为6.0 × 10^11（n = 8）、3.0 × 10^12（n = 8）和1.0 × 10^13 vg（n = 9）。所有患者在研究开始时均为NYHA III级心力衰竭。总体来看，接受治疗的患者显示出较安慰剂组更好的改善趋势；然而，大多数评估指标未达到统计学显著性，除了左室舒张末期容量。这项研究进一步确认了I期临床试验观察到的良好安全性结果。
CUPID II期临床试验的三年随访结果未能证明在生存率方面的显著改善。然而，对非终末事件的累积分析显示出统计学显著性，这为CUPID 2试验的开展提供了支持。CUPID 2试验共招募了250名患者，分别分配至治疗组（n = 123）和安慰剂组（n = 127）。与之前的试验类似，关键结果指标（如生存率）未显示出显著差异。有趣的是，接受治疗组的早期终末事件发生率*显著增加。
*早期终末事件（early terminal event）在临床试验中指的是那些在研究过程中发生的、与疾病不良预后直接相关的、并且通常会导致研究提前终止的严重事件。这些事件可能包括死亡、严重的疾病进展或其他对患者健康有重大影响的事件。它们是临床试验中重要的终点事件，因为它们直接关系到患者的安全和治疗的有效性。
其他研究分别探讨了rAAV1.SERCA2a在改善左室舒张末期容量（AGENT-HF）方面的效果，以及其在合并左室辅助装置（LVAD）患者中的安全性（SERCA-LVAD），并评估了循环中NAbs的影响。然而，这两项试验在CUPID 2试验结果令人失望之后均被终止。
尽管这些试验在临床结果上未取得显著改善，但它们确实展示了rAAV基因治疗在心脏病治疗领域的巨大潜力。目前，正在开发新的有前景的心脏基因疗法，包括使用rAAV9表达LAMP2B以治疗Danon病—一种引起严重心肌病变的X连锁遗传疾病。I期试验（NCT03882437）已完成招募，中期结果显示该疗法具有良好的安全性和临床改善，出现的血栓性微血管病（TMA）和急性肾损伤均通过治疗得到了缓解。相应的II期试验（NCT06092034）正在积极招募至少年满8岁的男性患者，作为单臂研究，采用单次静脉注射给药。预计该试验将在2025年完成。
癌症
在临床前研究中，rAAV展现了在抗癌领域的潜力，但其在人类中的应用仍然相对有限。截至目前，只有一项针对胃癌的体外基因治疗临床试验（NCT02496273）正在进行。因此，本节将重点介绍基于rAAV的肿瘤治疗策略及其在临床前的成就。
使用rAAV的抗肿瘤策略在目标和理念上与传统抗肿瘤方案相似。然而，基因治疗提供了独特优势，例如调节或降低特定基因的表达。rAAV可以转导分裂和非分裂细胞，使其能够在异质性肿瘤组织中广泛靶向不同细胞。这一特性可以用于将细胞因子转基因递送至肿瘤细胞，以招募免疫细胞并触发抗肿瘤免疫反应。
一项概念验证研究显示，在异种移植小鼠模型中，通过rAAV介导干扰素β（IFNβ）表达成功抑制了结直肠癌细胞。在一项非随机、非盲的回顾性人类研究中，将IFNβ联合替莫唑胺治疗可延长胶质母细胞瘤（GBM）患者的生存期。通过rAAV感染（rAAV.IFNβ）使肿瘤细胞启动IFNβ表达，可克服IFNβ的短半衰期并增强其治疗效果。这在侵袭性原位异种移植GBM的小鼠模型中也得到了验证，颅内给药几乎使总生存期增加了一倍。
尽管通过改造衣壳来递送癌症治疗手段具有高度的特异性，但这一方法费时又费力。一个替代方案是筛选现有的rAAV衣壳库，以确定不同给药方式下的最佳组合。例如，研究发现rAAV7和rAAV9在小鼠体内对前列腺组织具有较高的感染效率。这种对前列腺组织的增强感染可用于敲低与前列腺癌相关的miRNA，从而减缓小鼠前列腺癌模型中的疾病进展。
这些概念验证研究确实展示了rAAV在抗癌策略中的潜力。但在将这些研究成果应用于人类之前，还需解决一些关键问题。首先，持续表达治疗性转基因的安全性令人担忧，尤其是在肿瘤被清除或复发后。其次，与传统化疗类似，复发肿瘤可能对治疗产生抗性或能够逃避治疗，从而使持续的转基因表达失去效果。此外，细胞因子治疗通常伴有明显的副作用，未经调控的转基因表达可能会导致额外的并发症。因此，需改进基因治疗的调控策略，并对肿瘤生物学进行更深入的理解。