近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。前几章我们分别学习了AAV的基础知识、AAV的载体开发、AAV的生产工艺以及AAV的临床应用以及临床应用安全性中的免疫原性和应对策略，下面我们来继续学习综述的最后一部分：临床应用安全性中的副作用/毒性和应对策略。
副作用/毒性和应对策略
安全性始终是基因治疗开发中的首要关注点。尽管重组腺相关病毒（rAAV）因其良好的安全性而成为目前可用病毒载体中的首选，但它仍然存在一定的风险。本节将重点讨论rAAV在临床应用中引起关注的副作用（表4）。
表4 由rAAV给药引起的不良反应和毒性
野生型AAV在Rep蛋白等因子的帮助下可以整合到哺乳动物基因组中。然而，在rAAV中，唯一保留的野生型AAV元素是ITR，这本来应该可以降低基因组整合的风险。然而，动物模型的数据表明，野生型AAV和rAAV的病毒基因组整合概率相似。肝脏似乎是AAV整合的热点区域，但也在心脏等其他器官中发现了病毒基因组的整合。通常情况下，只有当基因组整合破坏了抑癌基因或激活了致癌基因时，才会对机体产生不良影响。AAV对肝脏的感染率很高，特别是通过静脉内给药时，因此肝细胞癌（HCC）成为特别关注的问题，并在动物研究中有更多的报道。有趣的是，一些易感因素，例如动物的年龄或潜在的肝脏疾病，与HCC的发生密切相关。相较之下，尚未在非人灵长类动物（NHPs）或犬类中观察到遗传毒性。尽管在人类中发现了野生型AAV基因组整合现象，但尚未证实其在肿瘤发展中的致病作用。同样，目前尚不清楚治疗性rAAV在人类基因组整合中的作用及其致癌潜力。
基因组编辑工具的应用日益广泛，尤其是CRISPR技术。在动物模型中发现，CRISPR诱导的双链断裂会增加rAAV基因组整合的几率，这给安全性带来了新的挑战。其它可能影响病毒基因组整合的因素包括rAAV血清型、启动子/增强子元件以及rAAV产品杂质等。总体而言，治疗性基因组整合的可能性和风险，及其在人类患者肿瘤形成中的作用，尚不明确。
通过静脉内注射高剂量的rAAV是一种实现不同器官（如肌肉和中枢神经系统）广泛转导的策略，然而，这种方法可能会引发肝毒性，因为大量的病毒颗粒在进入循环系统后会首先经过肝脏。肝毒性的早期迹象包括转氨酶水平升高，可以通过血液检测进行监测。这种升高可能在临床上无症状，但也可能进一步发展为肝损伤、肝衰竭，甚至导致死亡。预防性或治疗后使用皮质类固醇可以减轻肝毒性反应。静脉内给药后，肝毒性通常在治疗后的数周到数月内发生，表明免疫反应可能是肝毒性的主要原因。这一观点在血友病B的早期报告中得到了支持，其中观察到转基因表达的减少与针对rAAV衣壳的T细胞反应及转氨酶升高相关。
TMA被认为是由于内皮细胞损伤引起的，并伴随血小板聚集，导致微血栓形成、血小板减少，以及因缺血引起的内脏器官损伤，甚至可能导致死亡。TMA可能是获得性或遗传性的，其与rAAV基因治疗的关联性直到最近才被发现。尽管具体机制尚未完全明确，但已有研究提出rAAV输注可能导致补体系统的失调性激活。除了密切监测患者外，目前的应对策略主要集中在预防性免疫抑制方面。此外，也有使用支持性治疗、皮质类固醇、依库珠单抗和血浆置换成功治疗TMA的案例报道。目前，rAAV相关的TMA病例主要集中在Zolgensma和DMD试验中。至于哪些因素可能导致rAAV给药后更易发生TMA，目前尚不清楚。一些可能的患者特异性因素，如疾病表型和基础疾病的进程，开始引起关注。
DRG毒性：DRG毒性引起的感觉神经节炎症和神经元丢失，可能进一步扩展到脊髓背柱，这已成为近期关注的rAAV相关副作用。现有数据主要来源于啮齿动物、猴子和小猪的临床前研究，其中静脉内或脑室内输注rAAV与炎症浸润和神经元退化密切相关。尽管在临床前研究中DRG毒性可能不会表现出明显症状，但研究中已观察到动物出现本体感觉缺失*和共济失调#。组织病理学和临床症状通常会出现，但可能存在延迟，这表明毒性与转基因表达有关，而非病毒衣壳。对此的支持证据包括一项研究报告指出，在注射不表达外源基因的rAAV9载体后未观察到DRG毒性。最近，血清神经丝蛋白（NF）水平被提出作为一种潜在的生物标志物，但血清NF变化与DRG毒性的临床相关性尚不明确。此外，血清NF水平的变化可能与患者的基础疾病有关，是其自然病程的一部分，因此解释NF水平变化的结果变得更加复杂。
MRI发现：随着医疗技术的进步，检测的灵敏性不断提高，我们可以识别出过去无法检测到的细胞变化。这也带来了新的挑战，即如何解释这些发现以及判断它们是否具有临床相关性。比如，在脑实质内注射rAAV后，脑部MRI中检测到的变化就是一个例子。
在临床前研究中，直接将rAAV注射至脑实质会导致血管周围淋巴细胞聚集（即血管周围淋巴浆细胞性套）、微胶质细胞变化和神经元肿胀，这些变化主要出现在rAAV注射区域。有趣的是，在一项研究中，对照组也出现了类似变化。然而，随着剂量增加，T细胞和B细胞浸润的区域比例增加，表明这些变化可能是由注射操作和载体共同引起的。尽管在对照组和载体组中都观察到了MRI的变化，但不同的特征可能暗示了不同的病因。值得注意的是，这项研究中未发现任何临床症状。
在一项针对贝敦病（Batten disease）的临床试验中，用rAAV.rh10递送CLN2基因与输注后的MRI变化相关，这些变化在大多数受试者中持续至输注后12个月。重要的是，未观察到任何与这些MRI变化直接相关的临床症状。目前，输注后MRI变化的意义尚不明确，特别是在神经退行性疾病中，鉴别与疾病相关的变化、与注射操作及载体相关的影响可能十分困难。然而，理解这些潜在的分子和细胞机制对于患者安全和基因治疗的成功至关重要。
当前的认知差距和潜在的解决方案
基因治疗能否实现“一次治疗，终身有效”的承诺，取决于rAAV的持久性。在此不考虑因免疫反应导致的rAAV基因组或转基因表达丢失（相关内容已在rAAV免疫反应部分讨论），但与rAAV和患者相关的两个关键因素依然是表达盒的调控元件以及细胞的更新和存活。
内源性基因在时间和空间上受到严格的调控，这意味着特定基因在不同器官，甚至在同一器官内不同细胞中的表达水平在特定时间点会有所不同。目前常用的广谱启动子难以适应这种基因调控的差异。研究表明，转基因表达的丢失可能与rAAV表达盒设计中使用的启动子和其它调控元件的失活有关。此外，缺乏细胞或器官特异性的启动子也可能带来安全性方面的风险。一个可能的解决方案是使用治疗性转基因内源性启动子中的启动子和调控元件。然而，内源性调控元件通常超出rAAV的包装容量，因此需要进行优化，但这可能会去除必要的元件。一个有前景的例子是使用缩短版的SMN启动子来治疗SMA，这在小鼠实验中显示出疗效提升和毒性降低的效果。
使用部分启动子的一个挑战在于转基因表达可能在机体或患者的发育过程中出现波动。如果这种波动反映了内源性基因的表达情况，那么可能是理想的；但如果影响了治疗效果，则可能会带来问题。因此，更深入地了解治疗基因的生理性调控机制至关重要。
从宿主的角度来看，rAAV基因组的持久性和转基因的表达取决于细胞的半衰期。这可以通过神经元和肝脏这两个例子来说明。神经元被认为是终末分化的细胞，这意味着被感染的神经元在其整个生命周期内都会携带rAAV基因组。由于神经元数量在一生中不会显著增加，因此rAAV基因组不太可能因细胞增殖而被稀释或丢失。然而，在某些神经退行性疾病的治疗中，神经元可能持续丧失，最终导致rAAV基因组的丢失，从而影响转基因的表达。
相比之下，肝脏的细胞活动较为动态。肝细胞可以不断增殖，单个肝细胞的寿命约为三年，这可能会显著稀释rAAV基因组，甚至导致转基因表达的逐渐丧失，从而降低治疗效果。对于大多数疾病来说，这些因素尚未得到充分理解，可见深入了解分子和细胞水平疾病机制对于基因治疗成功和持久效果的重要性。
尽管目前rAAV基因治疗在人类中已展现出令人鼓舞、甚至改变生活的成果，但需认识到基因治疗仍是一个相对年轻的领域。接受rAAV基因治疗的患者数量的增加也是近年的成就。现在对治疗效果的持久性作出结论还为时尚早，特别是在管理治疗效果逐渐减弱方面，可能需要通过重新给药或结合细胞治疗等策略来实现。
在过去的几年中，我们对rAAV转导机制的理解有了显著提升。然而，目前尚不清楚在不同病理条件下的分子和细胞变化会如何影响rAAV的表现。例如，疾病状态可能会改变细胞谱系，从而影响目标细胞的群体分布。另一个复杂因素是，用于控制转基因表达的调控元件中可能也存在类似的动态变化。
基因治疗的目标是让每位患者受益，无论其疾病的阶段和进展情况如何。患者的临床试验入组资格是基于临床、生化和影像学的评估来确定的，这种方法只能大致估计疾病的阶段，但在预测疾病进展或对治疗的反应方面存在局限性。尽管当前的数据显示，早期治疗通常能带来更好的效果，但由于在定义疾病阶段及其与进展和治疗反应的相关性方面存在不足，可能使许多原本可以获得良好效果的患者被排除在外。例如，在两个独立的DMD rAAV试验中，对患者死亡的解释，就提出了两种不同的假设。这表明，我们对疾病动态的理解，特别是对基因治疗中疾病动态的理解，仍然有限。
克服这些挑战对于在疾病机制理解和rAAV改进方面取得进一步进展至关重要。例如，针对DMD的广泛肌肉组织靶向，只有通过静脉内给药才能实现。为了提高这种方法的安全性和有效性，必须对rAAV的衣壳进行改造，以增强特异性并降低所需剂量。尽管隔离肢体灌注可以作为一种替代手段，但它可能难以充分覆盖整个病变区域。不过，结合多种给药方式可能有助于发挥各自优势，减小单一途径的不足。
另一个例子是中枢神经系统（CNS）的广泛靶向。尽管目前正在测试限制rAAV在CNS空间内的新给药方式（如脑室内或脑实质内注射），但CNS的广泛感染似乎能够受益于其复杂的血管网络，这为静脉内rAAV给药提供了支持。新衣壳的设计和开发可能有助于提高穿透力和组织内扩散，从而减少静脉内给药的局限性，同时实现更广泛的细胞转导。
全文总结
其中一个关键挑战是如何将rAAV高效递送到目标组织，选择适当的给药方式对治疗成功有着重要影响。解决特定细胞或组织的靶向问题，以及克服物理屏障将是扩大目标疾病范围的关键。
rAAV的免疫原性是另一个主要挑战，它影响着基因治疗的安全性、持久性和有效性。调节和缓解免疫反应的策略，包括对患者的预存免疫、载体给药时的天然免疫反应，以及病毒衣壳和转基因诱导的适应性免疫反应进行管理，对于患者的安全至关重要。理解免疫反应的长期影响及其对重复给药的潜在影响也是必要的。
最后，更深入地了解rAAV的基因组整合，将有助于评估其对肿瘤形成、肝毒性、神经毒性，以及新发现的与高剂量rAAV相关的不良反应的潜在影响。解决这些问题对于提高治疗的安全性和患者的可及性至关重要。
尽管存在这些挑战，但一些令人鼓舞的方向正在推动rAAV基因治疗的发展。研究rAAV与宿主的相互作用对于指导载体的优化设计和增强转基因表达至关重要。实现长期转基因表达的策略，例如免疫逃逸或免疫抑制方案，可以延长治疗的有效期，减少重复干预的需求。根据疾病的具体需求定制rAAV治疗方案，如定制组织、细胞和基因特异性启动子，优化转基因设计，以及开发具有特定组织靶向性的衣壳变体，是另一令人振奋的方向。这些新设计的rAAV必须在不同物种中展现出兼容性，同时提升特性和安全性。
随着基因编辑技术的进步，将rAAV与CRISPR等基因编辑工具相结合，为精准和特异的基因修饰提供了巨大的潜力。这些进展将加速更高效的治疗方案的开发，涵盖从单基因疾病到复杂的多因素疾病。克服当前挑战并拥抱这些未来的发展方向，有望使基因治疗成为应对多种人类疾病的革命性工具。（全文完）