聚焦眼科基因治疗：AAV的潜力与突破–挑战与应对策略篇

研究发现，通过玻璃体内注射rAAV可引发抗AAV的系统性NAb产生。在血清NAb滴度较高的非人灵长类动物中进行眼部给药时，载体的转基因表达较弱甚至检测不到。有趣的是，无论NHP接受单眼注射还是双眼注射，两只眼睛的玻璃体液中的NAb滴度均趋于相同。由于临床上采集玻璃体液操作复杂且具有挑战性，因此在视网膜基因治疗前，通过评估血清中预先存在的NAb水平及BRB的完整性，可能成为一种替代性、可行的评估手段。

为了减少NAb对AAV的影响，研究人员正在设计新的视网膜靶向衣壳，用以替代传统的野生型AAV血清型（如AAV2和AAV8）。最近的一项小鼠眼部研究显示，注射到玻璃体腔内的抗原会通过视神经鞘的淋巴血管被引流至深颈部淋巴结，这一过程对于视网膜和中枢神经系统中抗原特异性CD8+ T细胞的生成起到了关键作用。研究还发现，通过VEGFC刺激增强淋巴引流会进一步抑制AAV载体在视网膜中的转导效率，而使用sVEGFR3抑制VEGFC信号则可以提升视网膜中AAV载体的重复给药效果。尽管该研究未直接评估玻璃体液中中和抗体的滴度，但结果表明，临时抑制眼部淋巴引流可能有助于减少抗AAV中和抗体的生成，从而提高基因治疗的有效性。这项研究为优化AAV载体的设计和使用提供了新的方向，尤其是在解决中和抗体相关挑战方面具有重要意义。

在临床实践中，与rAAV治疗相关的眼部炎症在接受视网膜下或玻璃体腔注射的患者中较为常见，这种炎症具有一定的剂量依赖性，但在临床前研究和临床试验中表现出显著差异。手术操作、给药方式、rAAV剂量、载体制备方式、启动子序列的选择、转基因的潜在毒性以及术前是否使用免疫抑制剂等多种因素，都会影响炎症的严重程度。玻璃体腔注射直接将AAV颗粒暴露于玻璃体和视网膜的免疫细胞中，因此与视网膜下注射相比，更容易引发免疫激活反应。在非人灵长类动物实验中，玻璃体腔注射AAV导致房水中出现短暂的细胞炎症，同时玻璃体内产生持续性炎症反应，且炎症程度与注射剂量成正比。通过去除空AAV衣壳以降低衣壳剂量，可以有效减轻炎症并提高转导效率。此外，玻璃体腔注射还会引发系统性NAbs的生成，但在注射后3个月内，细胞因子水平和视网膜炎症相对较低。在一项针对15名莱伯遗传性视神经病变（LHON）患者的临床试验中，使用rAAV2-ND4进行玻璃体腔注射后，患者的系统性免疫反应是短暂的，未引发严重炎症。而视网膜下注射由于更高的免疫豁免，通常引起的炎症较少。例如，在针对RPE65基因突变引起的2型莱伯先天性黑朦（LCA2）患者的试验中，术后炎症经过14天的类固醇治疗得到了有效缓解。然而，在针对脉络膜缺损症的rAAV2.REP1视网膜下注射试验中，有一名患者由于载体回流至玻璃体腔而出现了显著的玻璃体炎和视网膜炎，为此，该患者需要接受更长时间的免疫抑制治疗。总体来看，注射途径的选择、剂量的控制以及免疫抑制方案的优化，是减少rAAV治疗相关炎症的重要策略。

长期以来的研究结果表明rAAV的基因载荷，特别是含有未甲基化CpG序列的ITRs，可能会触发先天免疫反应，从而引发炎症。未甲基化CpG序列通过激活Toll样受体9（TLR9），在B细胞的活化和抗体生成中起到关键作用。研究发现，通过CpG寡脱氧核苷酸（ODN）刺激TLR9，会显著增强针对AAV8-SIINFEKL转导小鼠的OT-I（ SIINFEKL特异性）CD8+ T细胞反应。为了减轻这种免疫反应，研究人员开发了一种ITRs中不含CpG序列的AAV载体。尽管这种载体的转导效率与野生型ITRs载体相当，但在生产过程中载体产量明显下降。另一种策略是向载体中引入TLR9抑制序列。例如，将端粒来源的ODN序列TTAGGG插入到5′ ITR与GOI之间，在小鼠眼部实验中， GFP表达水平更高，CD3+和CD8+ T细胞的浸润减少。然而，这种改进策略在非人灵长类动物等大型动物中的效果尚需进一步验证。值得注意的是，目前尚无明确证据表明其它细胞内DNA受体（如AIM2、STING以及与I型干扰素通路相关的受体）参与了对rAAV携带的目的基因的识别。这些研究表明，通过优化CpG相关序列，可能有效降低rAAV引发的免疫反应，为提高其安全性和治疗效果提供了新的方向。

使用双载体进行基因转导的一个限制在于，两个载体的互补ITR可能形成环状串联，导致仅表达部分转基因，从而生成无功能蛋白。针对这一问题，研究人员探索了一种替代方法，即使用分裂内含肽（一种能够介导蛋白质反式剪接的天然多肽）。该方法通过将如ABCA4或CEP290等大蛋白分割为两个由分裂内含肽包裹的多肽片段，并通过反式剪接在动物模型中成功重建了完整蛋白。这种策略允许大基因序列适配于单个rAAV载体。尽管分裂内含肽介导的蛋白质反式剪接在扩展AAV载体大基因递送能力方面显示出潜力，其在人类中的安全性和有效性仍存在不确定性。尤其是，残留的非哺乳动物来源的内含肽可能引发安全性问题。一项研究发现，使用一种改良的E. coli二氢叶酸还原酶降解标签，可以显著减少反式剪接后内含肽的残留量，并在Stargardt病小鼠模型中验证了其安全性和有效性。这一结果为分裂内含肽技术在未来基因治疗中的应用提供了支持。

最近，美国罗切斯特大学Douglas M. Anderson课题组报告了一种利用核酶激活的mRNA转移连接来实现大基因递送的策略，称为StitchR（Stitch RNA）。该策略通过核酶切割两个独立的mRNA，激活了它们的无痕转移连接，最终在真核细胞中翻译成全长蛋白。在哺乳动物细胞中优化StitchR活性导致蛋白质表达量提高了约900倍，接近从单一载体表达的基因的表达水平。研究结果还显示，StitchR可以用于双AAV基因治疗，通过恢复大分子功能性肌肉蛋白至体内内源性水平来纠正肌营养不良症。点击文末阅读原文，进入派载体，了解更多关于StitchR的内容。

此外，为解决超大转基因的递送难题，研究还探索了高度简化的转基因版本。例如，在CEP290基因的研究中，两项试验分别使用编码miniCEP290基因或功能性CEP290片段的rAAV8进行视网膜下注射，显著改善了LCA小鼠模型中光感受器的存活率、形态和功能，与对照组相比效果显著。这些研究为超大基因递送提供了新的解决思路，也为基因治疗的进一步优化奠定了基础。

已有多种RPE特异性启动子被应用于rAAV研究中，包括RPE65、VMD2（或BEST1）和RPGR等。其中，人类RPE65启动子已被用于临床试验，通过视网膜下注射rAAV2/2载体来驱动RPE65基因的表达，以治疗2型莱伯先天性黑朦（LCA2）。然而，在一项试验中，接受注射的三名患者视力未显示显著的临床改善。相比之下，VMD2启动子在多项基于rAAV的动物研究中表现出较强的GOI表达能力，并能够特异地驱动GOI在RPE细胞中表达。这些结果表明，选择适合的启动子对于不同物种和目标细胞的基因治疗效果至关重要，同时也需要针对特定模型优化启动子以提高疗效和临床转化潜力。

最近的一项研究比较了多种光感受器和RPE特异性启动子，以评估它们在视网膜细胞中的安全性，特别是通过视网膜下注射rAAV后的影响。研究结果显示，常用的广谱启动子（如CMV、人UBC启动子和CAG）以及RPE特异性启动子（如VMD2）在形态学、炎症反应和生理功能方面均表现出一定的毒性，而光感受器特异性启动子（如人红视蛋白、人视紫红质、人视紫红质激酶和小鼠视锥视蛋白捕获蛋白）则未表现出明显毒性。AAV载体中启动子相关毒性的可能原因在于，广谱启动子（如CMV、人UBC和CAG）驱动的GOI高水平表达可能通过生成双链RNA或其他免疫刺激序列，激活先天免疫反应。相比之下，光感受器特异性启动子驱动的表达具有更高的特异性和较低的表达水平，因此未引发毒性。这一发现表明，启动子的选择对减少基因治疗中的不良反应至关重要。此外，研究还发现，RPE细胞和小胶质细胞对广谱启动子的敏感性较高，可能导致炎症反应加剧以及视网膜损伤。因此，优化启动子设计以提高特异性和减少免疫刺激，是改善基因治疗安全性的重要策略。

在rAAV衣壳设计方面，目前的研究聚焦于开发具有更高特异性、降低免疫原性并提高转导效率的载体。AAV2.7m8变体的问世标志着一个重要的突破，该变体通过玻璃体腔注射在啮齿动物中实现了优于AAV2的光感受器转导效果。然而，其在NHP中的疗效有限，说明仍需进一步创新。多个研究表明，即使借助AI辅助设计衣壳，并结合NHP的筛选数据，这些衣壳在NHP中通过玻璃体腔注射后，光感受器转导效率仅有小幅提升，显示出其在眼科基因治疗中的潜力仍然有限。这也表明，当前依赖高成本的NHP体内筛选策略可能并非找到在人类中具有强大光感受器转导能力的衣壳变体的最佳方法。

Deverman团队的一项最新研究采用了体外筛选方法，靶向人类转铁蛋白受体，这种受体在人类血脑屏障（BBB）中高度富集并参与跨细胞运输。研究识别出一种AAV9衣壳变体，能够高效穿越BBB并在非人灵长类动物的中枢神经系统细胞中实现转导。通过专注于识别能强效结合人类靶细胞或组织中受体的衣壳变体，该方法成功绕过了跨物种障碍，确保了在人类细胞中的高效转导。这一策略同样适用于眼科基因治疗的衣壳设计，尤其是靶向视锥细胞中表达的保守性受体，以优化玻璃体腔注射的效果。为进一步提升这一过程，可开发新的体外筛选平台，专门用于评估衣壳库的HSPG结合亲和力，并筛选出HSPG结合较少的衣壳。结合这些筛选方法，有望发现同时具备低HSPG结合能力和对光感受器受体高特异性结合能力的衣壳，从而显著提高玻璃体腔注射的光感受器转导效率，推动视网膜基因治疗的变革。

基因编辑技术

rAAV与基因编辑技术（尤其是CRISPR/Cas9）的结合代表了眼科基因治疗的前沿进展，为遗传性视网膜疾病的治疗带来了变革性的潜力。其中一个典型例子是利用rAAV递送CRISPR/Cas9治疗由CEP290基因突变引起的LCA10的临床试验（EDIT-101）。该试验在安全性和疗效方面取得了令人鼓舞的结果，其中64%的参与者在关键次要终点上表现出显著改善。

碱基编辑和先导编辑是新兴的基因组编辑技术，以不同机制实现基因突变的精确修复。碱基编辑利用一种改良的Cas9酶，在无需产生DNA双链断裂的情况下实现特定碱基的转换，而先导编辑通过结合Cas9单链切割酶与逆转录酶，可引入包括小插入和缺失在内的多种遗传改变。这两种技术在高精度修复多种基因突变方面展现了巨大的应用前景，有望进一步推动眼科基因治疗的发展。

由于碱基编辑和先导编辑器的体积超过了AAV的包装容量，其在基于rAAV的眼科基因治疗中的应用受到一定限制。然而，一项研究成功优化了双AAV分裂内含肽先导编辑器，并通过视网膜下注射将其递送至LCA的rd12小鼠模型中，该方法实现了高达16%的RPE65突变的精准校正，恢复了RPE65的表达，显著改善了视网膜和视觉功能，并保护了光感受器，同时未检测到明显的脱靶编辑。这一研究为先导编辑在遗传性视网膜疾病治疗中的潜力提供了成功的概念验证案例。

与DNA编辑相比，RNA编辑具有一些明显的优势，例如能够进行瞬时且可逆的修饰，从而减少基因组中永久性脱靶效应的风险。一项研究表明，使用AAV递送的CRISPR-Cas13bt3（一种新型RNA编辑器）在人体视网膜类器官和人源化小鼠模型中有效沉默了VEGFA。该研究还发现，在hESC来源的RPE细胞中，CRISPR-Cas13bt3显著降低了VEGFA mRNA的表达，并在小鼠的光感受器细胞中实现了对人类VEGFA的特异性敲低。

当前需要克服的主要挑战

为克服rAAV眼科基因治疗的局限性，研究人员正在探索多种创新策略。衣壳工程被用来开发免疫原性较低的AAV变体，以规避NAbs并减少免疫反应，特别是在玻璃体腔注射的情况下。此外，免疫抑制方案的优化和替代给药方式（如脉络膜上注射）的探索，旨在减少炎症反应并改善治疗效果。针对rAAV载荷容量有限的问题，研究人员正在开发双载体系统、StitchR、简化或分割的转基因策略，以提高大基因条件下的GOI表达效率和一致性。载体设计方面的进展，如使用重叠元件和蛋白质反式剪接技术，已经取得了成效。此外，优化更具高精度和细胞类型特异性的启动子等顺式调控元件，有助于提高靶向特异性，并降低视网膜毒性的风险。

针对治疗效果的差异性，更加个性化的患者筛选方法也逐渐受到重视。这些方法考虑到疾病的异质性、患者的年龄以及共病情况等因素，力求为每位患者制定量身定制的临床方案，从而实现一致且有效的治疗结果。AI在预测接受基因治疗患者的风险/收益比方面展现了巨大潜力。通过利用庞大的数据集，机器学习算法能够识别出临床医生或研究人员难以察觉的模式，从而根据患者的个体特征（如基因突变、视网膜退行性变化程度和整体健康状况）做出更为精准的预测。尽管如此，确保长期安全性和疗效仍然是首要任务。相关研究正在开发下一代载体和治疗方法，旨在提供持久的疗效并最大程度地减少潜在风险。