过表达慢病毒是一种基因传递工具，用于在细胞或动物体内高效表达目标基因。它的工作原理包括以下几个关键步骤：
1. 慢病毒载体构建
慢病毒是一种改造后的逆转录病毒，通常使用 HIV 的改良版本作为骨架。它的主要特性是能整合到宿主细胞的基因组中，实现目标基因的稳定表达。
目标基因插入：将感兴趣的基因插入到慢病毒载体的多克隆位点（MCS）中，同时加入调控元件（如启动子和增强子）以驱动基因表达。
标记基因：为了监测感染效率，常加入荧光蛋白（如 GFP、RFP）或抗性基因（如抗嘌呤霉素基因）。
2. 包装系统
为了安全性，慢病毒系统通常使用三质粒或四质粒系统：
包装质粒：编码病毒的结构蛋白（如 Gag 和 Pol），用于组装病毒颗粒。
包膜质粒：编码包膜蛋白（如 VSV-G），赋予病毒广泛的宿主范围。
转移质粒：含有目标基因及其表达调控元件。
（四质粒系统还可能包括辅助质粒，如 Rev 质粒，用于增强病毒颗粒生成。）
这些质粒通过共转染 HEK293T 细胞（或类似细胞系）来产生具有感染能力的慢病毒颗粒。
3. 病毒颗粒生产
转染宿主细胞：在 HEK293T 细胞中共同转染包装质粒和转移质粒，产生带有目标基因的病毒颗粒。
病毒收集与浓缩：收集细胞培养上清，经过超速离心或超滤浓缩病毒颗粒，以提高感染效率。
4. 靶细胞感染
将病毒颗粒感染靶细胞（如原代细胞、干细胞或动物模型中的细胞）。慢病毒具有较高的感染效率，可感染分裂和非分裂细胞。
感染后，病毒 RNA 被逆转录为 DNA，并整合到宿主细胞基因组中，使目标基因得以长期稳定表达。
5. 过表达原理
通过在慢病毒载体中使用强启动子（如 CMV 启动子或 EF1α 启动子），驱动目标基因的高水平表达，远高于细胞内的内源表达水平，从而实现基因的过表达。这种方法广泛应用于基因功能研究、蛋白质表达分析、疾病模型构建等领域。
优点与注意事项
优点：
高效、稳定的基因表达。
能感染多种细胞类型，包括分裂和非分裂细胞。
整合基因组，适合长期研究。
注意事项：
基因组整合可能引起插入突变，需谨慎设计实验。
慢病毒的生产和操作需在生物安全二级（BSL-2）实验室进行。
使用高滴度病毒时需防止细胞毒性。