腺相关病毒（AAV）因其高效、低免疫原性和长期表达等特点，已成为心血管疾病基因治疗的重要工具。其中，AAV9 已被广泛用于心肌细胞的基因转导并在小鼠体内显示出良好的心脏转导效率。然而，AAV9 在离体培养的心肌细胞（尤其是体外培养的新生大鼠心室肌细胞，NRVCMs）中的转导效率并不理想，研究人员常常不得不使用 AAV6 进行体外实验，再在体内试验阶段切换回 AAV9，费时费力。
近期，德国石勒苏益格-荷尔斯泰因大学医院（University Hospital Schleswig-Holstein）及其合作者在 Human Gene Therapy上发表了一项新成果，通过在新生大鼠心室肌细胞上进行多轮筛选，从AAV9随机肽段库中成功获得了在体外和体内心肌细胞中均能高效表达目的基因的新型 AAV9 血清型变体，为心肌疾病的个性化基因治疗提供了新的思路。
文章图1 在DNA和RNA水平上的AAV9肽库筛选可富集不同的变体。(A) AAV9肽库最初在新生大鼠心室肌细胞（NRVCMs）中经过三轮筛选。在第一轮DNA筛选后，对七肽插入片段进行亚克隆。随后，利用第二轮筛选的DNA和RNA分别构建二级AAV9文库，并用于第三轮筛选。(B) 接着，通过下一代测序（NGS）分析基因组DNA（gDNA）和cDNA，根据总读数百分比展示每轮筛选的前50个基序。(C) 在DNA筛选的gDNA水平和RNA筛选的cDNA水平上，前20个基序的相对比例以饼图形式展示。排名前五的变体以颜色标出，其余读数汇总为浅灰色。
对每二轮筛选所得病毒变体的 DNA 与 RNA 进行高通量测序，比较各变体在转导与表达方面的优势，结果显示两种筛选方式各有偏向：在 DNA 水平高度富集的变体往往具有更好的“进细胞”能力，而在 RNA 水平富集的变体则更注重下游的基因表达效率。
文章图2 基于条形码文库和下一代测序（NGS）技术，在转导和基因表达水平上对新鉴定的衣壳变体进行平行表征。(A) 每个筛选水平上表现最佳的10种衣壳分别被制成携带CMV启动子驱动的eYFP报告基因和独特条形码（BC）的AAV9变体，条形码位于3′-非翻译区。将不同变体以等量混合后，这些条形码标记的AAV文库用于以1×10⁵的感染复数（MOI）转导新生大鼠心室肌细胞。转导3天后，提取DNA和RNA，通过NGS测定单个条形码的频率，校正输入文库中丰度的差异，并分别以转导效率（B，白色）和表达效率（C，灰色）的形式呈现每个变体的结果。AAV9-AERYTKY以绿色标出。通过DNA和RNA筛选鉴定的AAV衣壳变体分别以黑色和灰色下划线标出。数据为使用同一条形码标记的AAV文库进行的三次技术重复的单个数据点，并以标准差（SD）表示。
文章图3. 体外对单个AAV衣壳变体的表征。(A) 在条形码变体验证中，转导和/或表达效率表现最佳的AAV衣壳被单独检测。这些衣壳以1×10⁴的感染复数（MOI）转导新生大鼠心室肌细胞。转导3天后，通过流式细胞术检测eYFP阳性细胞数量（深灰色），并计算每孔的平均荧光强度（MFI，浅灰色）。数值以平均值表示，附标准差（SD，n = 3，技术重复两次），MFI以AAV6野生型为参照进行相对表达。采用单因素方差分析（ANOVA）与AAV6野生型进行统计学比较。(B) 通过免疫荧光染色（DAPI：蓝色，α-actinin：红色，eYFP：绿色）直接比较AAV9-AERYTKY与AAV6野生型的表达效率。(C) 此外，将AAV9-AERYTKY与AAV9-RGDLGLS（一种用于体内靶向心肌组织的基准AAV9衣壳变体）的表达效率进行了并列比较。AAV9-AERYTKY以绿色标出。数据以平均值表示，附标准差（SD，n = 4，技术重复两次，AAV来自两次独立生产）。采用单因素方差分析（ANOVA）与AAV9-AERYTKY进行统计学比较。
2.在小鼠体内实验中，研究人员将 AAV9-AERYTKY 与野生型 AAV9 进行对比，结果显示 AAV9-AERYTKY 在小鼠心肌内保持了与 AAV9 相当的高效表达，同时在其他器官如肝脏的分布与表达也没有出现“脱靶增强”，安全性表现良好。
文章图5 AAV9-AERYTKY与AAV9野生型在体内的比较。在小鼠体内分别比较了AAV9-AERYTKY和AAV9野生型的表达效率。通过眼眶后注射将AAV载体系统性地注入雌性FVB小鼠体内（每只小鼠注射2.5×10¹¹个病毒基因组），并在3周后收集组织样本。(A)心脏和肝脏的组织学染色，使用DAPI（蓝色）和eYFP（橙色）进行标记。(B) 提取DNA以通过监测每二倍体基因组中的总病毒基因组数来确定生物分布。数据以平均值表示，附标准差（SD，n = 3）。(C) 提取RNA以检测指定器官中的eYFP mRNA水平。数值以核糖体蛋白L32（RPL32）为参照进行标准化，并以AAV9野生型为基准进行相对表达。AAV9-AERYTKY以绿色标出。采用双尾非配对t检验来确定统计学差异。
3.在人源心脏组织模型 hEHT（human engineered heart tissue）中，AAV9-AERYTKY 同样显著提高了荧光蛋白的表达水平，且对组织活力与收缩功能无明显影响。这一结果为其在更具临床相关性的“类器官”平台中应用提供了依据。
文章图6 在人源工程心脏组织中评估选定的AAV衣壳变体。在体外表现出最高表达效率的AAV衣壳变体被用于测试其转导人源工程心脏组织（hEHTs）的能力。hEHTs分别以2.5×10⁴的感染复数（MOI）接受AAV9野生型和变体的转导，或以2.5×10³的MOI接受AAV6野生型的转导（用“#”标注）。(A) 转导7天后，对工程心脏组织（EHTs）进行成像。(B) 测定了eYFP的荧光强度。(C) 此外，分别在转导前和转导7天后评估了组织的收缩力。数值以平均值表示，附标准差（SD，n = 3）。AAV9-AERYTKY以绿色标出。采用单因素方差分析（ANOVA）与AAV9野生型进行统计学比较。
- 突破“体外-体内鸿沟“：AAV9-AERYTKY 成功实现了在体内与体外心肌细胞模型之间的一致性，大大简化了研究流程，也有利于缩短科研周期。
- 机理尚待深入探索：研究表明，肽插入的具体序列可能影响病毒衣壳与细胞表面受体的结合、病毒脱壳及基因组释放等多个步骤，不同插入序列可能针对“进入细胞”和“高表达”这两个环节分别发挥作用。
- 转化应用：AAV9-AERYTKY 有望在基因治疗、药物筛选和心肌疾病基础研究等多方面发挥作用，尤其是在心脏类器官、iPSC-CMs 模型和体内动物实验之间搭建“统一”的病毒载体平台，为后续更精准的个体化心脏基因治疗提供支持。
值得注意的是本研究中用到了携带eYFP荧光蛋白和barcode的AAV，用于平行筛选多种AAV血清型变体。派真生物可为您提供携带多种荧光蛋白和barcode的AAV，助力您筛选获得适合您实验的最佳AAV血清型。