在AAV（腺相关病毒）载体构建中，启动子的选择直接影响基因表达的效率、特异性、持续时间和安全性。以下是根据不同需求选择启动子的关键考虑因素和常见策略：
1. 根据目标组织的特异性选择
- 组织/细胞特异性启动子
- 肝脏：TBG（甲状腺素结合球蛋白启动子）、LSP（肝特异性启动子）。
- 神经系统：Synapsin（神经元特异性）、GFAP（胶质细胞特异性）、CaMKIIα（神经元活性依赖性）。
- 肌肉：CK（肌酸激酶启动子）、MCK（肌肉肌酸激酶启动子）。
- 视网膜：RPE65（视网膜色素上皮特异性）、hGRK1（视杆细胞特异性）。
- 心脏：cTnT（心肌肌钙蛋白T启动子）。
优势：降低脱靶表达，提高安全性。
- 广谱/组成型启动子
- CMV（巨细胞病毒启动子）：高表达，但易被表观沉默，长期表达不稳定。
- CAG（复合启动子，含CMV增强子）：强驱动，广泛用于多种组织。
- EF1α（延伸因子1α启动子）：在分裂和非分裂细胞中稳定表达，适合造血系统或干细胞。
适用场景：无需组织特异性时的高效表达。
2. 根据表达强度和持久性选择
- 高强度启动子：CMV、CAG，适用于需要高剂量蛋白表达。
- 中等强度启动子：EF1α、PGK（磷酸甘油酸激酶启动子），适合平衡表达与毒性风险。
- 长效表达：避免CMV（易沉默），优先选择EF1α、合成启动子（如miniPromoter）或内源性启动子（如Alb启动子）。
3. 考虑AAV包装容量限制
- AAV载体的基因组容量上限约4.7 kb，需选择小型启动子：
- 短启动子：如miniCMV（缩短的CMV）、sCAG（紧凑型CAG）。
- 合成启动子：通过优化序列减小尺寸。
- 若需大片段（如携带多个基因或调控元件），需牺牲启动子长度。
4. 免疫原性与安全性
- 避免免疫原性元件：某些病毒启动子（如CMV）可能含CpG岛，触发免疫反应，长期表达受限。
- 内源性启动子（如人源化启动子）或合成启动子可降低免疫风险。
5. 物种特异性优化
- 启动子活性可能因物种而异（如CMV在小鼠中强，但在灵长类中较弱）。
- 临床前研究需验证启动子在目标物种中的活性（如使用人源化启动子进行非人灵长类实验）。
6. 实验验证策略
- 体外预实验：通过报告基因（如GFP、Luciferase）在目标细胞中测试启动子活性。
- 体内验证：在小鼠或类器官模型中评估表达效率、特异性和持久性。
- 表观沉默检测：长期实验中监测启动子甲基化状态（如CMV易被沉默）。
选择启动子需权衡组织特异性、表达强度、尺寸限制、免疫原性及物种兼容性，最终方案需通过实验验证。对于临床转化，优先选择人源化或低免疫原性启动子，并关注长期表达稳定性。