腺相关病毒（AAV）载体是基因治疗中最广泛使用的递送工具之一，然而，AAV中和抗体（NAb）的存在对AAV载体的初次或重复给药构成了重大障碍。近期发表在《Molecular Therapy》上的一项研究展示了一种创新的免疫调节策略：通过CD19靶向嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法成功清除AAV Nab，这一研究为解决AAV基因治疗中的免疫屏障提供了重要的前沿进展。
一、研究背景
AAV基因治疗近年来取得了显著进展，已被批准用于治疗多种遗传性疾病，包括脊髓性肌萎缩症（SMA）、血友病A和B等。然而，AAV NAb的存在显著限制了AAV载体的疗效，尤其是在需要重复给药的情况下。AAV NAb通过阻止载体与靶细胞结合或引发网状内皮系统清除，导致基因转导失败。
目前的免疫调节策略（如CD20单抗、血浆置换等）在清除高滴度AAV NAb方面效果有限，而已有的临床研究结果显示CD19 CAR-T能够有效清除骨髓、脾脏、淋巴结和淋巴组织中的CD19阳性B细胞亚群，因此，研究人员推测，靶向CD19的免疫疗法可能通过靶向更广泛的B细胞亚群（包括浆细胞）来更有效地清除AAV NAb。
二、研究结果
1. CD19 CAR-T疗法显著降低AAV NAb滴度
研究团队在小鼠模型中评估了CD19 CAR-T疗法对AAV NAb的清除效果。实验结果显示，接受CD19 CAR-T治疗的小鼠外周血和组织中的B细胞及浆细胞几乎完全被清除。在接受AAV8载体免疫的小鼠中，CD19 CAR-T治疗后，AAV8 NAb滴度从1:484显著降低至1:6，相比之下，未接受CAR-T治疗的小鼠NAb滴度持续升高，达到1:9,670以上（文章图1）。
文章图1. 抗CD19治疗有效清除预存的AAV8中和抗体。A) AAV8免疫和CAR-T治疗的方案。C57Bl/6小鼠在全身照射（XRT）前两周以4×10¹² vg/kg的剂量接受AAV8免疫，随后进行CAR-T细胞输注。CAR构建物包括未转导的对照组（NTD，○，n=15）或CD19（△，n=10）。每隔两周收集外周血。B) XRT对AAV8中和抗体滴度的影响。小鼠接受AAV8免疫后，两周后不进行XRT（○，n=5）或进行XRT（△，n=5），并跟踪AAV8中和抗体滴度4周。C) 外周血CD19+ B细胞的定量和D) NTD（○）或CD19（△）CAR-T治疗后AAV8中和抗体滴度。在NTD（○）或CD19（△）治疗组中，分别在第0周（阴影条）和第10周（空白条）进行抗AAV8总IgG（E）或IgM（F）的ELISA检测。虚线表示检测下限。
2. CD19 CAR-T疗法实现AAV载体的重复给药
为了验证NAb清除是否足以支持AAV载体的重复给药，研究人员在CAR-T治疗11周后再次给予小鼠AAV8载体。结果显示：CD19 CAR-T治疗组的小鼠成功实现了AAV8载体的重复给药，并观察到与未免疫小鼠相当的转基因表达水平。未接受CAR-T治疗的小鼠由于高滴度NAb的存在，未能实现有效的基因转导（文章图2）。
文章图2. 抗CD19 CAR-T细胞有效耗竭AAV8中和抗体，从而允许在重复输注AAV8载体后实现转基因表达。A) AAV8重复给药方案。在接受NTD（○，n=11）或CD19（△，n=7）CAR-T治疗后的第11周，小鼠接受编码人类FVIII的AAV8载体输注，剂量为4×10¹² vg/kg（正方形）或4×10¹³ vg/kg（三角形）。同时，未预先接受AAV8免疫的对照小鼠接受全身照射后输注CAR-T细胞，并在11周后以相同剂量输注AAV8-hFVIII。B) NTD小鼠（○）与CD19治疗小鼠（△）在AAV8载体再次给药后的AAV8中和抗体滴度。C) AAV8再次给药后第10周的FVIII抗原表达。先前接受AAV8免疫的小鼠（AAV+，空心符号）与未接受AAV8免疫的小鼠（AAV-，实心符号）的FVIII抗原水平相当。NTD小鼠未检测到hFVIII表达。D) AAV8再次给药后第10周的AAV载体拷贝数（VCN）。先前接受AAV8免疫的小鼠（AAV+，空心符号）与未接受AAV8免疫的小鼠（AAV-，实心符号）的VCN相当。NTD小鼠未检测到VCN。E) 初次CAR-T细胞输注后30周，CAR-T细胞在注射小鼠的骨髓中持续存在。F)初次CAR-T细胞输注后30周，CAR-T细胞在注射小鼠的脾脏中持续存在。
3.单克隆抗体疗法的局限性
研究还比较了单克隆抗体（mAb）疗法与CAR-T疗法的效果。尽管mAb疗法能够部分清除外周血中的B细胞，但对骨髓和脾脏等组织中的B细胞和浆细胞作用有限，导致AAV NAb滴度未显著降低。这一结果表明，清除组织驻留的B细胞和浆细胞是清除AAV NAb的关键。
三、研究结论
这项研究首次证明了CD19 CAR-T疗法在清除高滴度AAV NAb方面的有效性，并为AAV载体的重复给药提供了可行的解决方案。研究还揭示了清除组织驻留B细胞和浆细胞在AAV NAb清除中的重要性。
此外，研究表明，CD19 CAR-T疗法不仅可以清除已有的AAV NAb，还可能在B细胞缺失期间防止新的AAV NAb形成，这一发现为未来AAV基因治疗的临床应用提供了重要的理论依据。
四、未来展望
尽管CD19 CAR-T疗法在小鼠模型中表现出显著的疗效，但其临床转化仍需进一步研究。以下是未来需要关注的几个关键问题：
- 安全性与耐受性：CAR-T疗法可能导致长期的B细胞缺失及相关副作用，需权衡其风险与收益。
- 条件预处理方案：研究中使用了全身放射预处理以促进CAR-T细胞的植入，未来需探索更温和的预处理方案。
- 成本与可及性：CAR-T疗法的高成本可能限制其在非致命性疾病（如血友病）中的应用，需开发更经济的替代方案，如mRNA CAR-T疗法。
总而言之，CD19 CAR-T疗法为解决AAV基因治疗中的免疫屏障提供了全新的视角。通过清除高滴度AAV NAb，有望显著扩大AAV基因治疗的适用人群，并为重复给药提供可能性。