慢病毒荧光蛋白质载体

慢病毒荧光蛋白质载体（Lentiviral Fluorescent Protein Vector）是一种结合慢病毒载体系统和荧光蛋白报告基因的工具，广泛应用于基因表达调控、细胞示踪、感染效率检测以及细胞分选等领域。

1. 慢病毒载体的基本结构

慢病毒载体基于HIV-1病毒改造而成，具有感染分裂和非分裂细胞的能力。其核心组成包括：

转移质粒（Transfer Plasmid）：携带目标基因（如荧光蛋白基因）和包装所需的顺式作用元件（如LTR、Ψ包装信号）。

包装质粒：提供病毒结构蛋白（Gag、Pol）和调节蛋白（Rev）。

包膜质粒：通常使用VSV-G蛋白（水泡性口炎病毒G糖蛋白）扩大宿主范围。

荧光蛋白基因（如GFP、RFP、mCherry、tdTomato等）通常被插入转移质粒中，与目的基因（如shRNA、过表达基因）共表达或独立表达。

2. 荧光蛋白的作用

标记转导细胞：荧光蛋白作为报告基因，通过荧光显微镜或流式细胞术快速识别被病毒感染的细胞。

定量分析：通过荧光强度评估病毒转导效率（如计算GFP阳性细胞百分比）。

细胞追踪：长期表达荧光蛋白可用于活细胞动态观察（如干细胞分化、肿瘤转移）。

3. 载体构建要点

启动子选择：

强启动子（如CMV、EF1α）：驱动荧光蛋白高表达，适用于快速检测。

弱启动子（如PGK）：减少细胞毒性，适用于长期实验。

诱导型启动子（如Tet-On/Off）：可调控荧光蛋白表达。

4. 常用荧光蛋白类型

5. 实验流程

（1）载体构建：将荧光蛋白基因克隆至慢病毒转移质粒。

（2）病毒包装：将转移质粒与包装质粒共转染至HEK293T细胞，收集上清中的病毒颗粒。

（3）感染细胞：加入Polybrene（提高感染效率），感染目标细胞。

（4）荧光检测：

显微镜观察：直接可视化荧光信号。

流式分选：分选荧光阳性细胞（如GFP+细胞）。

定量PCR/WB：验证目的基因表达。

6. 注意事项

生物安全：慢病毒属于BSL-2级病原体，需在二级生物安全柜中操作。

脱靶效应：高滴度病毒可能导致非特异性感染，需优化MOI（感染复数）。

荧光淬灭：长期培养时选择光稳定性强的荧光蛋白（如mCherry）。

对照实验：设置空载体对照（仅表达荧光蛋白）和未感染对照。

7. 应用场景

基因沉默/过表达：结合shRNA或cDNA研究基因功能。

细胞谱系追踪：标记特定细胞群并观察其命运（如神经干细胞分化）。

体内成像：通过荧光活体成像技术监测肿瘤生长或转移。

CRISPR编辑：与Cas9/sgRNA共表达，筛选基因编辑成功的细胞。