腺相关病毒(AAV)载体因其安全性高、长期表达稳定、免疫原性低及可靠的组织靶向性等特点，已成为基因治疗的首选工具。然而，AAV载体最大的局限性是其有限的基因包装容量（约为4.7kb），这一限制使得AAV载体很难直接递送编码序列超过4kb的基因，因为完整的表达盒还需包含启动子、多聚腺苷酸信号(polyA)等调控元件 （图1）。
图1 野生型AAV和rAAV的结构示意图[1]
当需要递送编码序列超过4kb的基因时，拆分基因并使用双载体(Dual Vector)策略是一种行之有效的解决方案。那么要如何拆分基因，拆分基因时的关键考量因素有哪些呢？本文将详细介绍大基因拆分的关键考量因素，助力您设计最佳的拆分策略。
1. 常见的AAV双载体策略
目前有三种主要的双载体策略用于递送大基因：
1.1重叠(Overlapping)双载体策略
原理：将基因分成两部分，在拆分位点附近设计重叠序列。当两个载体共同感染同一细胞时，通过重叠区域的同源重组来重建完整基因 （图2）。
优势：设计相对简单，需要的外源DNA元件较少。
考量：重组效率很大程度上取决于重叠区域的长度和序列特性。
图2 重叠策略示意图
1.2 剪接(Trans-splicing)双载体策略
原理：将基因在内含子处拆分，在第一个载体的3’端添加供体剪接位点，在第二个载体的5’端添加受体剪接位点。转录后，mRNA通过反式剪接重组 （图3）。
优势：可以利用天然内含子位点，减少蛋白结构干扰。
考量：剪接效率取决于选择的剪接位点质量和位置[2]。
图3 剪接策略示意图
1.3 混合(Hybrid)双载体策略
原理：结合重叠和剪接策略的优点，即使用重叠区域促进重组，同时添加剪接位点。
优势：提供两种重建途径，理论上可提高成功率 （图4）。
考量：设计更为复杂，但在某些情况下可能提供更高的表达水平。
图4 混合策略示意图
2. 大基因拆分的关键考量因素
2.1 蛋白质结构域
结构域完整性：拆分点应避开关键功能域，最好位于不同结构域之间的连接区域，以保留蛋白质各部分的折叠和功能完整性[3]。
二级结构：分析蛋白质的二级结构元素(如α螺旋和β折叠)，避免在这些结构中间拆分。
三级结构影响：考虑拆分后两部分是否能在体内正确折叠并相互作用，恢复蛋白质的三维结构 [1]。
2.2 基因内含子-外显子结构
内含子拆分优先：优先选择在内含子区域拆分，这样在mRNA反式剪接过程中，可以自然去除连接序列。
保护外显子：尽量避免在外显子中拆分，特别是含有关键功能编码的外显子 [2]。
剪接效率：如果必须在外显子处拆分，需评估剪接位点的强度并可能需要优化剪接信号。
2.3 氨基酸序列
避开功能性位点：拆分点应避开活性位点、底物结合位点、磷酸化位点等功能关键的氨基酸位置[4]。
柔性区域选择：选择蛋白质中的柔性环区(flexible loops)作为拆分点通常能减少对蛋白功能的干扰。
保守性分析：通过跨物种的序列比对，识别高度保守区域(通常功能重要)和低保守区域(可能更适合作为拆分点)[1]。
2.4 载体设计
表达调控元件分配：需合理分配启动子、增强子和polyA信号等元件，确保两个片段都能有效表达。
序列优化：可能需要进行密码子优化，以去除潜在的隐性剪接位点或其他干扰序列。
连接序列设计：重叠区域的长度(通常≥400bp)和GC含量需要优化，以促进高效重组。
转导效率：考虑AAV血清型对目标组织的转导效率，确保两个载体能够共同感染足够比例的细胞[5]。
2.5 重组机制
转录后重组：在反式剪接策略中，需评估内含子剪接强度和效率。
DNA水平重组：在重叠策略中，需考虑重组位点的同源性和长度对重组效率的影响。
蛋白质重组：如使用split-intein策略，需评估intein序列的选择及其在目标组织中的活性。
3. 实验验证和优化策略
体外测试：先在体外表达系统中测试不同拆分位点的效果，评估重组效率和蛋白功能。
报告基因辅助：可在两个片段中加入不同的荧光报告基因，以便监测共转导效率和表达水平。
AAV制备优化：考虑通过分级纯化技术富集含有完整转基因的AAV颗粒。
载体比例优化：通过测试两种AAV载体的不同比例，筛选出共递送效率最优的组合。
4. 常见挑战与解决方案
重组效率不高：可通过优化重叠区域长度、使用更高效的剪接位点或采用混合策略来提高效率。
杂合体形成：重组过程可能产生非预期的杂合体，需通过序列优化和实验筛选减少这种情况。
表达水平不足：可能需要使用更强的启动子或考虑优化密码子以提高表达水平。
组织特异性差异：根据目标组织的不同，需合理选择AAV血清型和启动子。
5. 总结
2）评估蛋白质的结构域分布，选择在结构域之间的非保守区域拆分；
3）根据目标组织特性选择最适合的双载体策略和AAV血清型；
4）在体外系统中验证几种候选拆分方案，评估重组效率和功能恢复情况；
5）最终在动物模型中验证最佳拆分策略的有效性。
参考资料
[1]. Marrone, L., P.M. Marchi and M. Azzouz, Circumventing the packaging limit of AAV-mediated gene replacement therapy for neurological disorders. Expert Opin Biol Ther, 2022. 22(9): p. 1163-1176.
[2]. Ivana Trapani, P.C.A.S., Effective delivery of large genes to the retina by dual AAV vectors. EMBO Mol Med, 2013. 6: p. 194-211.
[3]. Riedmayr, L.M., et al., mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun, 2023. 14(1): p. 6578.
[4]. She, K., et al., Dual-AAV split prime editor corrects the mutation and phenotype in mice with inherited retinal degeneration. Signal Transduct Target Ther, 2023. 8(1): p. 57.
[5]. Reisinger, E., Dual-AAV delivery of large gene sequences to the inner ear. Hear Res, 2020. 394: p. 107857.