知识分享

在进行基因功能研究时，开展“加法”实验是常用的科研思路。构建过表达稳转细胞株可有效实现基因的上调，其中慢病毒转染是最常用的构建方法，可达到长效稳定的调控效果。今天就向大家介绍慢病毒过表达载体的构建。   首先，我们要确定目的基因序列，即目的基因的转录本。然后根据实际需求选择合适的慢病毒载体骨架和相应的元件。下面通过一个常规的慢病毒载体骨架来介绍不同元件的特点(图1)。 图1. 慢病毒过表达载体...

慢病毒属(lentivirus)在分类上属于逆转录病毒科，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主，导致感染个体发病。慢病毒感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病，因此被称为慢病毒。慢病毒通常与免疫系统和中枢神经系统的慢性疾病有关，如人类免疫缺陷病毒(HIV)会导致艾滋病。 图1 慢病毒的典型形态 慢病毒载体的结构 1）野生型HIV-1的基因结构...

1、如何计算需要加入的病毒量？ 通过MOI计算。MOI(Multiplicity of Infection，感染复数)是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高，证明细胞越难被感染。一般我们把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。 相关计算公式： 每孔所加病毒量(μL)=MOI×细胞数/病毒滴度(TU/mL)×1000 MOI=(病毒滴度×病毒体积)/细胞数目 病毒滴度可通过荧光计数法进行确定。 2、慢病毒感染细胞，铺板密度是多少？...

一、什么是慢病毒包装？  ...

慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂(图1)。...

腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(parvoviridae)家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体(recombination adeno-associated virus,...

一、rAAV包装简介：   重组腺相关病毒的生产主要基于三质粒(核心质粒pAAV-GOI/shRNA、血清型质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper)共转染HEK293T细胞。包装细胞反式提供rAAV的结构蛋白Cap及功能蛋白Rep，并在辅助质粒pHelper的帮助下，高效地将带有ITR的目的DNA片段包装到包装到rAAV病毒颗粒中。 图1 rAAV的生产流程 1. rAAV载体构建...

一、腺相关病毒   腺相关病毒(Adeno-Associated...