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慢病毒感染后观察效果的时间因细胞类型和实验条件而异，但通常在感染后48-72小时可以观察到较为明显的感染效果。以下是具体说明： 1. 荧光表达观察 对于带有荧光标记（如GFP）的慢病毒，感染后48小时通常可以看到荧光表达，但荧光强度在72小时左右达到峰值。如果细胞代谢较慢（如原代细胞），可能需要72-96小时才能观察到明显的荧光。 在感染后72小时，荧光表达通常较为稳定，适合用于评估感染效率。 2. 非荧光标记的慢病毒 如果慢病毒没有荧光标记，可以通过qPCR、Western...

MOI值过高会对细胞产生多方面的负面影响，主要包括以下几点： 1. 细胞毒性增加 MOI值过高意味着细胞暴露于大量病毒颗粒，这会显著增加细胞的代谢负担，导致细胞的生理功能受损。细胞可能会出现生长缓慢、形态异常（如皱缩、变圆等），甚至死亡。 2. 感染效率不再提升 当MOI值过高时，细胞已经接近饱和感染状态，继续增加病毒颗粒并不会显著提高感染效率。此时，细胞状态可能会进一步恶化，但感染效率却不再有明显提升。 3. 细胞代谢负担加重...

慢病毒感染效率不高可能由多种因素导致，以下是主要原因及分析： 1.病毒自身因素 病毒滴度低：如果慢病毒的滴度过低，意味着单位体积中病毒颗粒数量少，细胞接触到病毒颗粒的概率降低，从而导致感染效率不高。 病毒活性不足：病毒在制备、运输或保存过程中，若操作不当，如反复冻融、长期暴露在室温等，会导致病毒活性下降。例如，每次冻融会使病毒滴度降低约10%，-80℃保存半年以上需重新测定滴度。 病毒包装制备问题：在慢病毒的包装过程中，若质粒质量差（如污染、降解）、包装质粒和载体质粒比例不合适，或转染效率低，都会影响病毒颗粒的质量和数量。...

质粒载体（Plasmid Vector）和病毒载体（Viral Vector）是基因工程中常用的两种工具，它们在结构、功能和应用方面既有相似之处，也有显著差异。以下是它们的异同点： 一、相同点 1.基因转移功能： 两者的主要功能都是将外源基因导入宿主细胞中，实现基因的表达或调控。 都可以用于基因治疗、基因编辑、蛋白质表达等研究和应用。 2.可改造性： 质粒载体和病毒载体都可以通过基因工程技术进行改造，插入特定的启动子、增强子、终止子、标记基因等元件，以满足不同的实验需求。 3.安全性：...

AAV（腺相关病毒）滴度检测是 AAV 生产和研究中至关重要的一步。常见的 AAV 滴度检测方法包括以下几种： 1. qPCR（定量PCR） 原理：通过荧光定量PCR检测AAV基因组（vg，viral genome），常检测 ITR 区域或特定的转基因片段。 优点：灵敏度高，重复性好，适用于绝对定量。 缺点：不能区分完整和缺失基因组的病毒颗粒。 2. ddPCR（数字PCR） 原理：采用数字PCR技术，对 AAV 样本进行绝对定量，能够提高准确性。 优点：无需标准曲线，精确度高，可检测低拷贝样本。 缺点：仪器昂贵，实验时间较长。...

质粒生产AAV（腺相关病毒）的原理主要基于重组AAV载体的构建和包装过程，以下是其详细原理和流程： 1. AAV载体构建 目的基因克隆：首先将目的基因克隆到AAV载体质粒中，该质粒包含AAV的反向末端重复序列（ITR）。ITR是AAV基因组的重要组成部分，负责引导病毒载体基因组的复制和包装。 质粒纯化：构建完成后，对质粒进行纯化，确保质粒的浓度和纯度符合要求。 2. 三质粒共转染系统 AAV的生产通常采用三质粒共转染系统，包括以下三种质粒： 表达载体质粒：包含目的基因和ITR序列，用于携带外源基因。...

AAV病毒、慢病毒和腺病毒在基因治疗中各有特点，以下是它们基本特性的对比： 特性 AAV（腺相关病毒） 慢病毒 腺病毒 病毒科属 细小病毒科（依赖辅助病毒） 逆转录病毒科 腺病毒科 基因组类型 单链DNA（ssDNA） 单链RNA（ssRNA） 双链DNA（dsDNA） 复制依赖性 需辅助病毒（如腺病毒） 自主复制（无需辅助病毒） 自主复制 载体容量 小（约4.5 kb） 中等（8-10 kb） 大（8-36 kb，部分改造后更大） 免疫原性 低（外壳蛋白免疫原性弱，适合体内治疗） 中等（可能引发免疫反应，但低于腺病毒）...

AAV（腺相关病毒）包装后，病毒的收集时间一般取决于细胞系、转染方法和培养条件。常见的AAV生产体系是293T或HEK293细胞，以下是常规的病毒收集时间参考： 1.最佳收集时间 在常见的HEK293细胞系统中，AAV病毒通常在转染后 48-72小时 达到较高的滴度。这是病毒产量最高的时间段。 2.过早或过晚收集的影响 过早收集（如24小时）：可能导致病毒滴度较低，因为病毒尚未充分复制和包装。 过晚收集（超过72小时）：细胞可能开始死亡，释放大量细胞碎片，增加下游纯化的难度，并可能降低病毒质量。 3.病毒存在的位置...

腺相关病毒（AAV）作为基因编辑工具的载体，因其安全性高、免疫原性低、能稳定表达外源基因等优点，广泛用于基因治疗和基因编辑。以下策略可用于优化AAV的基因编辑效率： 1. 优化AAV载体 启动子选择：使用强启动子（如CMV、CAG）或组织特异性启动子（如Syn、Alb）以提高目标基因的表达。 增强子元件：添加增强子（如WPRE、ITR）来增强基因表达。 衣壳蛋白改造：通过定向进化或理性设计改造衣壳蛋白，提升其感染效率和靶向性。 2. 优化基因编辑工具...

在动物实验中使用腺相关病毒（AAV）作为基因递送载体，需要特别关注以下关键注意事项，以确保实验成功并降低潜在风险： 1. 病毒制备与质量控制 病毒滴度：确保AAV病毒的滴度足够高，以实现有效的基因传递。常用的滴度范围为 10^12−10^14 vg/mL。 纯度检测：检查病毒制剂中是否存在内毒素、病毒残留蛋白或其他污染物。 基因插入效率：确认目标基因的插入是否成功，避免意外突变或不完全表达。 2. 动物模型选择...