知识分享

在实验室中，保存和分装腺相关病毒（AAV）需要遵循特定的步骤和注意事项，以确保病毒颗粒的活性和稳定性。以下是常规的AAV保存与分装方法： 1. 保存条件 温度选择： 短期保存（1-2周）： 建议保存在 4°C。 长期保存（数月到数年）： -80°C是最佳选择，可显著减少病毒颗粒活性的损失。 避免反复冻融： 反复冻融会导致病毒活性显著降低。分装为小体积（如10 μL或50 μL）可避免重复冻融。 2. 缓冲液选择 避免使用含高浓度盐或不稳定组分的缓冲液，防止对病毒颗粒的结构造成影响。 3. 分装步骤 1.准备工作：...

AAV（腺相关病毒）是否需要纯化取决于你的实验需求和下游应用。以下是一些情况分析，帮助你判断是否需要纯化： 1. 需要纯化的情况 体内实验（动物实验）：为了避免宿主免疫反应、提高感染效率，AAV通常需要纯化以去除细胞碎片、蛋白质和其他杂质。 临床前或临床研究：制备高纯度的病毒是必要的，以保证安全性和一致性。 高感染效率的需求：纯化后的AAV具有更高的滴度和更低的杂质，可以提高实验效果。 对结果敏感的实验：例如功能验证实验，杂质可能影响结果的解读。 2. 不需要纯化的情况...

在实验或生产中收集腺相关病毒（AAV）的最佳时间取决于所使用的生产系统（如 HEK293 细胞系统）以及病毒的产生速率和细胞状态。 1. 细胞收集时间 常见的生产系统：如三质粒共转染法（使用 HEK293 细胞），AAV病毒通常在转染后 48-72小时 达到较高的滴度。 注意事项： 过早收集：可能会导致病毒滴度较低。 过晚收集：细胞开始死亡，释放过多的细胞碎片，增加下游纯化的难度。 实验中可以根据时间点（如 24h、48h、72h）收集样品，分析病毒滴度以确定最佳收集时间。   2. 病毒存在的位置...

慢病毒感染后荧光表达较弱可能与以下几个方面有关： 1. 病毒滴度不足 病毒浓度较低会导致感染效率低，导致荧光信号较弱。 解决方案：提高病毒滴度，优化病毒制备步骤，例如使用更高质量的包装试剂和细胞系。 2. 感染条件不佳 感染条件（如MOI、感染时间、细胞类型等）可能不够理想。 3. 荧光蛋白表达效率低 慢病毒载体中荧光蛋白的表达可能受启动子或构建设计的影响。 解决方案： 检查载体中使用的启动子是否适合目标细胞。 使用高效表达的荧光蛋白，例如EGFP或mCherry。 4. 细胞类型不敏感...

慢病毒包装后，病毒颗粒的产生和释放需要一定时间。通常情况下，根据所使用的慢病毒包装系统和细胞系，可以参考以下时间点： 1.24小时后换液 转染后大约 24小时 需要更换培养基，去除转染试剂和残留的有毒物质，加入新鲜培养基以利于病毒颗粒的产生。 2.48-72小时收集病毒上清 转染后 48小时 开始，慢病毒颗粒通常已经开始大量释放，可以开始收集病毒上清。为了提高病毒滴度，建议在 48小时和72小时 两个时间点分别收集上清。 3.重复收集 如果细胞状态良好（未明显死亡或脱落），可以继续在 96小时...

慢病毒包装出毒量很低的原因可能与以下几个方面有关，可以逐一排查： 1. 质粒质量 质粒浓度与纯度：质粒的质量是影响病毒滴度的关键因素。如果质粒被污染（如蛋白、RNA 或内毒素过多），会影响细胞转染效率，导致病毒滴度低。 质粒配比：包装系统中质粒的摩尔比例（例如载体质粒与包装质粒的比例）需要准确。 2. 转染效率 转染试剂选择：使用低效的转染试剂会导致质粒不能有效进入细胞。建议选择高效的转染试剂。 细胞状态：转染细胞的状态对病毒生产至关重要。例如，HEK293T细胞应处于良好增殖状态（对数生长期），并且细胞融合度控制在...

慢病毒感染效率低可能与以下几个因素有关，以下是一些可能的原因和优化建议： 1. 病毒滴度低 包装的慢病毒浓度不足，导致细胞无法有效感染。 解决方案： 优化慢病毒的包装流程，例如选择高效的包装细胞系（如293T细胞）。 增加病毒颗粒的浓缩步骤（如超速离心或PEG沉淀）。 确保使用高效的质粒体系（如第三代包装系统）来生成高滴度病毒。 2. 细胞类型的感染敏感性...

AAV（腺相关病毒，Adeno-Associated Virus）的血清型由其衣壳蛋白（capsid protein）的结构决定。具体来说，AAV的血清型主要由编码衣壳蛋白的 cap 基因 序列变化引起，不同的血清型具有不同的表面抗原特性，从而决定了它们的免疫原性、细胞感染特异性和组织嗜性。 关键决定因素： 1.衣壳蛋白（Cap Protein） AAV的衣壳由三种蛋白质（VP1、VP2 和 VP3）组成，这些蛋白由同一个 cap 基因通过不同的起始密码子翻译生成。不同的血清型在 cap...

腺相关病毒（AAV）包装失败的原因可能涉及多个环节，可能与以下因素有关： 1. 质粒质量问题 污染：质粒中存在细菌、内毒素或其他杂质可能干扰包装过程。 质粒比例不匹配：结构质粒（Rep/Cap）、包装质粒和目标质粒的比例不合适会影响病毒颗粒的生成。 辅助病毒污染问题：在使用辅助病毒进行AAV包装时，如果辅助病毒的污染程度较高，可能会对AAV的包装和纯化过程产生干扰，导致包装失败。 2. 细胞状态不佳 细胞活力低：用于包装的细胞（如HEK293T）状态差或活力不足会降低病毒产量。 传代过多：细胞长期传代会导致病毒包装效率下降。...

选择适合特定实验的腺相关病毒（AAV）血清型是实验设计中的关键步骤。以下几个因素可以帮助你确定最合适的血清型： 1. 靶组织或细胞类型 不同AAV血清型具有不同的组织/细胞特异性。例如： AAV1：高效感染肌肉组织。 AAV2：经典血清型，广泛用于神经系统，但效率可能受到受体表达限制。 AAV5：对神经元和肺组织有较好亲和力。 AAV6：偏好肺和肌肉组织。 AAV8和AAV9：在肝脏、心脏、肌肉和中枢神经系统表现出高感染效率，AAV9还可以穿越血脑屏障。 AAV-DJ：人工优化血清型，适用于多种组织。...