知识分享

是的，腺相关病毒（AAV）虽然通常被认为是低免疫原性的载体，但仍然可能引起机体的免疫反应，具体包括以下几个方面： 1. 针对AAV衣壳蛋白的免疫反应 抗体反应：许多人在自然环境中已经暴露于野生型AAV，因此可能携带针对AAV的中和抗体。这些抗体会在AAV载体治疗时中和病毒颗粒，降低治疗效果。 T细胞反应：AAV衣壳蛋白可能被机体的免疫系统识别，引发细胞毒性T细胞（CTL）的反应，尤其是对载体进行多次注射时，这种反应更为明显。 2. 针对AAV转染细胞的免疫反应...

如果在 AAV 病毒包装过程中忘记换液（通常是指未及时更换培养基或未更换感染介质），可能会对病毒的产量和质量产生一定影响。以下是可能的后果以及补救措施： 可能的后果 1.细胞状态受损：（1）长时间不换液可能导致培养基中的营养耗尽，细胞生长状态变差，甚至出现死亡。 （2）废物和代谢产物的积累可能对细胞产生毒性。 2.病毒产量降低：细胞状态的恶化可能导致病毒的复制和包装效率下降，从而影响最终病毒的产量。 3.病毒质量下降：如果培养基中的废物过多，可能会干扰病毒的纯化，增加背景杂质。   补救措施...

是的，AAV（腺相关病毒）反复冻融可能会对其活性和稳定性产生不利影响，每次冻融都会导致病毒滴度降低约10%左右‌。以下是原因及建议： 反复冻融影响： 1.病毒颗粒的降解或聚集：冻融过程中，温度的剧烈变化可能导致病毒颗粒的结构被破坏或发生聚集，从而降低感染效率。 2.蛋白质变性：AAV的衣壳蛋白在反复冻融中可能发生变性，影响其稳定性和功能。 3.基因组的丢失或损伤：AAV的DNA在反复冻融时可能受到剪切或解离，从而影响基因传递效率。 4.效价降低：多次冻融会显著降低AAV的滴度，导致实验效果不稳定。   建议：...

在使用腺相关病毒（AAV）之前，正确的解冻步骤至关重要，以确保病毒载体的活性和效能不会受到影响。以下是解冻AAV的通用步骤： 1.准备工作 确保实验环境无菌，避免污染。 准备好装有病毒的冷冻管（通常储存于 -80℃）。 确保手头有干冰或预冷的冰盒以避免温度过高。 2.逐步解冻 快速解冻：将病毒冷冻管从 -80℃取出，立即置于 37℃水浴中。 注意：水浴中水位不能超过冷冻管盖，以防止污染。 轻轻晃动冷冻管，避免剧烈摇晃，以防损伤病毒颗粒。 3.监控解冻过程：解冻时间一般为 1-2 分钟，待冰块完全融化后立即从水浴中取出。...

慢病毒使用前解冻的步骤如下： 1.准备解冻环境： （1）确保实验环境无菌，使用生物安全柜操作，避免病毒污染和外部污染。 （2）准备好病毒存储管、无菌移液器等必要的器材。 2.取出慢病毒： （1）从液氮罐或-80°C冰箱中取出慢病毒管。 （2）尽量减少病毒离开低温环境的时间，迅速将病毒放入冰浴或手中轻轻温暖。 3.解冻慢病毒： （1）将慢病毒管放在冰上，或置于4°C冰箱中缓慢解冻，避免温度骤变导致病毒失活。...

慢病毒包装常用于基因编辑和基因治疗研究。慢病毒包装通常需要以下关键质粒（plasmid）： 1. 表达质粒（Transfer Plasmid） 含有目标基因（GOI, gene of interest）的表达框架。 通常包含慢病毒的 5'LTR 和 3'LTR 序列，用于病毒基因组的包装和整合。 常见载体：pLenti 系列、pLV 系列等。 2. 包装质粒（Packaging Plasmid） 提供慢病毒的包装蛋白（如 Gag、Pol、Rev）的编码基因。 这些蛋白是病毒颗粒组装和基因组复制所必需的。...

腺相关病毒（AAV）是一种常用的基因治疗载体，但其基因组容量有限。AAV载体的最大有效包装容量通常为 4.7 kb（4700碱基对） 左右。这包括了目的基因和所有必要的调控元件（如启动子、增强子、终止信号等）。 如果插入的序列超过了这个限制，可能会导致以下问题： 1.基因组不稳定：超过容量的AAV可能会导致病毒包装效率显著降低，甚至无法成功包装。 2.功能受损：超载可能影响AAV的感染效率或目的基因的表达。 优化策略 为了在有限的容量内表达较大的基因，可以考虑以下优化策略：...

慢病毒（Lentivirus）载体的基因插入容量通常在 6-8 kb 左右。具体来说： 1.有效容量： 慢病毒载体的全基因组长度通常限制在 8-10 kb，这包括病毒的必要元件（如长末端重复序列 LTR、包装信号 ψ 和启动子等）。 剩余的插入片段容量一般为 6-8 kb，具体取决于载体设计和病毒的包装效率。 2.超出容量的风险： 如果插入片段超过推荐容量，病毒的包装效率会显著降低，病毒颗粒的稳定性也可能受影响，导致转导效率下降。 3.优化策略： 如果插入片段较大，可考虑使用更小的启动子或筛选简化的元件。...

在腺相关病毒（AAV）包装过程中，需要特别注意以下事项，以确保实验的成功和病毒的高效生产： 1. 质粒的选择和纯化 质粒纯度：使用高质量的质粒（如 endotoxin-free）是包装成功的关键，因为内毒素可能影响转染效率和细胞活性。 质粒比例：三质粒包装系统（Rep/Cap、腺病毒辅助质粒和目标载体质粒）中，质粒比例需要优化（通常为 1:1:1 或适当调整）。 质粒保存：质粒应避免反复冻融，建议分装保存。 2. 细胞培养 细胞株选择：常用 HEK293T 或 HEK293 细胞，这些细胞对AAV的包装效率高。...

慢病毒包装后可能出现的一些常见问题包括以下几个方面： 1. 病毒滴度低 可能原因： （1）质粒的质量差（纯度低、降解）。 （2）转染效率低（细胞状态不佳、转染试剂效果不佳）。 （3）慢病毒元件（包装质粒和表达质粒）比例不合适。 （4）包装细胞培养条件（如培养基、pH值）不佳。 （5）目的基因对病毒生成有抑制作用。 解决方案： （1）确保质粒纯度达到OD260/280在1.8~2.0之间，使用柱提质粒。 （2）优化转染条件，使用高效转染试剂，保证细胞状态健康（生长汇合度70~90%）。...