知识分享

眼科疾病一直是rAAV基因治疗的前沿领域。截至2023年12月，已有78项临床试验正在进行或已完成，旨在研究rAAV在治疗眼科疾病中的应用（图1）。其中，15%的试验针对新生血管性年龄相关性黄斑变性（neovascular AMD），14%的试验与莱伯先天性黑蒙2型（LCA2）相关。超过60%的试验处于早期阶段（Ⅰ期和Ⅰ/Ⅱ期），主要关注治疗的安全性；此外，15%的试验已进入Ⅲ期阶段，与2019年之前的分析相比，数量有了显著增加。在这些试验中，rAAV2是最常用的血清型，成为基因治疗的主导载体。 图1...

腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）是一个常用于基因治疗的病毒载体，因为它具有较低的免疫原性和较好的基因转导效率。AAV的保存主要依赖于以下几个方面： 1.短期保存：如果在短时间内（3天内）将使用AAV病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存。 2.长期保存：对于长期保存，建议将AAV病毒放置于-80℃冰箱保存，可以存放6个月以上。如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。...

在进行慢病毒包装后的细胞培养过程中，收集的病毒上清是否需要冻存，取决于后续的实验计划和时间安排。以下是一些常见的处理建议： 1. 短时间内使用 如果收集的病毒上清会在几天内使用（如直接进行感染实验），可以将其储存在4℃中短期保存，但要注意避免超过5天，防止病毒滴度降低。 2. 长期储存 如果暂时不使用，建议将病毒上清分装后存放-80°C或液氮罐中保存，以确保病毒的活性和滴度稳定。慢病毒的结构相对稳定，-80℃冻存对其感染能力影响较小。 注意事项： 分装：尽量避免多次冻融，分装成小体积（如单次使用量）。 无菌操作：防止污染。...

AAV（腺相关病毒）的三质粒包装系统是一种常用的生产重组AAV的方法。这种方法基于三种质粒的协同作用，确保目标基因被包装到AAV颗粒中，同时维持病毒的高效生产和安全性。以下是其基本原理： 1. 三质粒的组成 质粒1：携带目标基因的质粒 包括目标基因及其调控元件（如启动子和增强子）。 两端有 ITR（反向末端重复序列），是AAV基因组的必要元件。ITR引导基因组被包装到病毒颗粒中。 质粒2：包装质粒 提供AAV的 Rep 和 Cap 基因，分别负责复制AAV基因组和组装病毒衣壳。 Rep 基因：负责基因组的复制和整合。 Cap...

腺相关病毒（AAV）已成为眼科基因治疗的主要平台，并在临床应用中取得了显著成果。首个眼科基因治疗药物Luxturna已获批上市，用于治疗RPE65相关的莱伯先天性黑蒙（LCA）。然而，AAV基因治疗的开发仍面临诸多挑战，包括免疫反应、载荷容量有限，以及如何提高玻璃体内递送时的感染效率等。我们将以最近发表在Molecular Therapy杂志（IF=12.4）上的一篇综述为参考资料，讨论AAV眼科基因治疗的临床研究进展，重点关注针对遗传性视网膜疾病和获得性病症的临床试验，探讨免疫反应带来的限制和改善AAV载体性能的新策略。...

慢病毒包装系统常用的三质粒系统包括以下三种质粒： 1、包装质粒（Packaging Plasmid） 包含编码病毒结构蛋白的基因（如 Gag、Pol）。这些基因在病毒颗粒的形成和组装中起重要作用，但不包含包装信号，因此不会被包装到病毒颗粒中。 2、包膜质粒（Envelope Plasmid） 通常是编码包膜蛋白的质粒，最常见的是 VSV-G（G蛋白，源于囊泡性口炎病毒）。VSV-G蛋白能赋予病毒广泛的感染能力，使其能够感染多种类型的细胞。 3、转移质粒（Transfer Plasmid）...

慢病毒载体（Lentiviral Vector）是一种基因递送工具，基于慢病毒（如人类免疫缺陷病毒，HIV）的改造而来。慢病毒属于逆转录病毒，其核心特点是能够将外源基因稳定整合到宿主细胞的基因组中，从而实现持久的基因表达。 一、基本原理 1、逆转录和基因整合 慢病毒的遗传物质是RNA。感染细胞后，病毒会利用其逆转录酶将RNA转录为双链DNA，并通过整合酶将该DNA插入宿主细胞基因组中。这种整合能力使慢病毒能够在宿主细胞及其子代中长期表达目标基因。 2、改造和安全性优化 为了用于基因治疗或研究，天然的慢病毒经过了一系列改造：    ...

第二代和第三代慢病毒载体系统是基因治疗和基因研究中常用的工具，它们的主要区别在于安全性、基因组结构以及辅助质粒的数量。 1. 基因组结构和安全性 第二代慢病毒系统 使用三个质粒：包装质粒（包含 gag 和 pol 基因）、包膜质粒（一般是 VSV-G）和转移质粒（携带目标基因）。 包装质粒中包含的病毒基因（gag、pol 和 rev）仍然存在一定的病毒基因组片段，有低概率发生病毒重组，安全性较第三代低。 安全改进：删除了 env 基因，转而使用异源包膜（如 VSV-G），大大减少了重组机会，但仍然需要 rev 基因。...

第三代慢病毒包装系统在基因治疗和基因功能研究中得到了广泛应用，相比于第一代和第二代系统，它在安全性和效率方面具有显著优势。以下是它的主要优点： 1. 更高的生物安全性 分离关键元件：第三代系统将慢病毒的关键基因（如 gag、pol 和 rev）分布在多个质粒上（通常是 3~4 个），有效减少了不同质粒间重组的可能性，从而降低产生复制型病毒的风险。 去除非必要病毒基因：保留的仅是病毒包装所需的最基本基因，例如 gag、pol 和 rev，删除了编码病毒结构蛋白的基因（如 tat），进一步降低了潜在的安全隐患。 2. 提高转染效率...

慢病毒、腺病毒及腺相关病毒（AAV）是三种常见的病毒载体类型，广泛用于基因治疗和生命科学研究领域。它们各自具有不同的特点和应用场景。 1. 慢病毒（Lentivirus） 特点： 基因组类型： 属于逆转录病毒，携带RNA基因组。 整合能力： 能将外源基因整合到宿主细胞的基因组中，导致持久表达。 感染范围： 可感染分裂细胞和非分裂细胞，具有广谱宿主范围。 包装容量： 通常为8-10 kb左右。 应用： 基因功能研究： 长期稳定表达外源基因或用于RNA干扰（如shRNA）。 疾病模型构建： 构建转基因或基因敲除细胞系。 基因治疗：...