知识分享

过表达慢病毒转染细胞后，基因的表达通常可以在 24-48 小时 内开始检测到，但最佳检测时间通常是 72 小时或更长，具体取决于以下因素： 1.病毒滴度：高滴度病毒感染更快，基因表达可能更早出现。 2.细胞类型：不同细胞的感染效率不同，影响表达时间。 3.启动子强度：使用强启动子（如 CMV 启动子）时，基因表达通常更快、更强。 4.检测方法灵敏度：荧光报告基因（如GFP）可能在24小时通过流式或显微镜观察，而低丰度蛋白需更长时间。 检测方法： 1.荧光蛋白（如 GFP）：通常 24-48 小时后可用荧光显微镜观察到。...

腺相关病毒（AAV）是一种广泛用于基因治疗的载体，针对视网膜疾病的基因治疗通常需要选择合适的AAV血清型，以确保高效的基因递送和表达。不同的AAV血清型对视网膜的不同细胞类型具有不同的亲和力。以下是几种常用于靶向视网膜细胞的AAV血清型： 1. AAV2 特点：经典的视网膜靶向AAV血清型，具有较高的神经元亲和力。 应用：已在多种基因治疗临床试验中使用，如RPE65基因突变相关的莱伯先天性黑蒙（LCA）。 细胞靶向性：视网膜色素上皮细胞（RPE）、视网膜神经节细胞（RGC）、光感受器细胞。 2. AAV8...

腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）是一种单链DNA病毒，属于细小病毒科（Parvoviridae）依赖病毒属（Dependoparvovirus）。AAV具有广泛的宿主范围，能够感染多种哺乳动物细胞，包括人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬等。其宿主范围特点如下： 1. 广泛的哺乳动物感染性 AAV可以感染多种哺乳动物细胞，但由于其复制依赖腺病毒（AdV）或单纯疱疹病毒（HSV）等辅助病毒，因此通常不会引起明显的细胞病变。 2. 主要宿主...

基因疗法药物载体的适用性取决于其进入细胞、将遗传物质递送到细胞核（或细胞质）以及维持基因表达的能力。关键因素包括病毒载体的复制方式、核进入机制以及基因整合能力。以下是常见载体如何适用于分裂和非分裂细胞的原因： 1. 更适用于分裂细胞的载体 腺病毒（ADV, Adenovirus） 特点: 主要在细胞核外表达，不整合基因组 适用范围: 主要适用于分裂细胞，但也能在某些非分裂细胞中短期表达 原因: 由于不整合到宿主基因组中，基因表达会随细胞分裂逐渐稀释   2. 适用于分裂细胞和非分裂细胞的载体 慢病毒（LV,...

AAV（腺相关病毒）作为基因治疗中的常见病毒载体，其生产工艺主要包括以下几个关键步骤： 1. 质粒构建 重组质粒（载体质粒）：包含目的基因（转基因）和AAV的反向末端重复序列（ITRs）。 辅助质粒（帮助质粒）：提供AAV复制所需的辅助功能，通常包括腺病毒的辅助基因（如E2A、E4和VA基因）。 包装质粒：包含AAV衣壳蛋白（Cap）和复制蛋白（Rep）的编码序列。 质粒扩增与纯化：通过细菌扩增、提取和纯化高质量的质粒DNA，确保质粒DNA不含任何与工艺或产品相关的杂质。 2. 细胞培养 常用的AAV生产细胞系包括：...

在AAV（腺相关病毒）载体构建中，启动子的选择直接影响基因表达的效率、特异性、持续时间和安全性。以下是根据不同需求选择启动子的关键考虑因素和常见策略： 1. 根据目标组织的特异性选择 组织/细胞特异性启动子 肝脏：TBG（甲状腺素结合球蛋白启动子）、LSP（肝特异性启动子）。 神经系统：Synapsin（神经元特异性）、GFAP（胶质细胞特异性）、CaMKIIα（神经元活性依赖性）。 肌肉：CK（肌酸激酶启动子）、MCK（肌肉肌酸激酶启动子）。 视网膜：RPE65（视网膜色素上皮特异性）、hGRK1（视杆细胞特异性）。...

在基因治疗和基因递送领域，GOI（Gene of Interest，目的基因）在AAV（Adeno-Associated Virus，腺相关病毒）载体中扮演核心角色。以下是其具体作用和相关背景： 一. AAV载体的基本功能 AAV是一种非致病性病毒，广泛用于基因治疗中的基因递送工具。其特点包括： 安全性：天然无致病性，需要辅助病毒（如腺病毒）才能复制。 长期表达：能在宿主细胞中长期稳定表达外源基因。 低免疫原性：相比其他病毒载体（如腺病毒），引发的免疫反应较弱。...

干扰慢病毒shRNA的生物安全级别通常为生物安全二级（BSL-2/P2），但需根据具体实验操作类型和病毒特性调整。以下是综合分析： 1. 慢病毒载体的生物安全特性 慢病毒载体（如shRNA干扰载体）经过基因改造，删除了病毒复制和致病相关的基因（如HIV的_env_、_gag_等），仅保留转导功能，因此属于复制缺陷型病毒。这类病毒无法在宿主细胞内自主复制，仅能通过辅助质粒在包装细胞中一次性生产，安全性较高。 2. 生物安全等级划分依据 BSL-1/P1：适用于无致病性或低风险的微生物（如部分分子克隆操作）。...

慢病毒转染实验需要适当的防护措施，因为慢病毒载体具有一定的生物安全风险。尽管第三代和更高级的慢病毒系统已被设计为复制缺陷型（replication-deficient），但仍需采取生物安全防护措施，以防意外暴露或污染。以下是主要的防护要点： 1. 生物安全级别 慢病毒通常属于生物安全2级（BSL-2）操作范围，因此实验室需符合BSL-2标准。 如果使用某些高致病性基因或高滴度病毒颗粒，可能需要提升至BSL-2+或BSL-3级别。 2. 个人防护（PPE） 穿戴实验服（建议一次性防护服）。 佩戴手套（双层手套更安全）。...

腺相关病毒（AAV）颗粒在某些情况下可能会聚集在一起。 可能引起因素： 1.病毒颗粒的高浓度：当AAV在高滴度（>10¹³ vg/mL）储存时，颗粒之间可能会发生相互作用，导致聚集。 2.缓冲液成分：AAV在某些缓冲液（如PBS）中可能不够稳定，而在含有适量盐和表面活性剂的缓冲液中更稳定。 3.pH和温度变化：AAV在极端pH或高温条件下容易发生变性，从而导致颗粒聚集。 4.病毒衣壳的电荷：AAV的表面电荷在某些溶液条件下可能促进颗粒间的静电相互作用，导致聚集。 5.冻融循环：反复冻融会破坏病毒颗粒的完整性，并促进聚集。...