常见问题
什么是AAV?
腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA病毒，目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病。它由蛋白衣壳（capside）和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。蛋白衣壳由三个亚基组成，分别为VP1，VP2，和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。
作为基因疗法载体的重组腺相关病毒（rAAV）携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除，取而代之的是治疗性转基因（transgene）。AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是：一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量，另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。
rAAV在感染细胞后会头尾相连形成环状，能长期存在而不被细胞系统当作外源DNA降解，因此可以在哺乳动物器官或组织中长期保留，并且只有极低的整合基因组机率。这个特性使AAV成为基因治疗的首选载体，也同样成为科学研究中在动物体内传递外源基因的一个优异载体。
AAV作为新一代基因治疗载体，还有一个很重要的特性在于其特异性强。得益于AAV的不同血清型，每种血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力，配合以合适的注射方法，会取得更好的效果。如果您做动物实验，建议首选AAV。
rAAV作为基因传递载体，包装外源序列的上限是多少？
rAAV的基因组包装上限约为5Kb，除去两端ITR序列各145bp，则能容纳4.5Kb的外源序列；即：启动子+外源基因+终止信号的总长度不能超过4.5kb;派真的K104载体提供了目前最小的广谱启动子miniCMV(CMV的核心区域,180 bp)及终止子（50 bp）表达盒，可表达约4.4Kb长度的基因，已是能包装基因长度的极限。
scAAV和ssAAV的区别
双链AAV（scAAV）感染后2~3天表达水平可到达峰值，单链AAV（ssAAV）感染后表达到达峰值的时间需要约7天；因为单链AAV进入细胞后必须变成双链DNA才能转录和翻译外源基因，这个过程非常缓慢；双链AAV（scAAV）感染效率比单链AAV(ssAAV)有6-15倍的提高；相同的滴度，双链AAV（scAAV）的生产规模需要比单链AAV（ssAAV）的生产规模大，所以双链AAV的包装价格更贵一些。
rAAV滴度单位GC/ml代表什么？如何检测？
GC代表genomic copies，基因拷贝数；GC/ml表示每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数；派真生物采用SYBRgreen 荧光定量PCR检测AAV的滴度，同时用ATCC标准品校正；特异性PCR引物是针对ITR区；派真生物提供的滴度是1E+13GC/ml以上； V.G./ml：Vector Genomes/ml的缩写，也是表示AAV病毒载体的滴度，等同于GC/ml。也是指每ml病毒液中含有的基因组拷贝数。通常用点杂交（dot-blotting）方法、QC-PCR方法、real time-PCR方法来测定。通常在测定前对样品用DNaseI处理，因此该滴度表示方法一般指每ml病毒液的病毒颗粒中含有的基因组拷贝总数。
rAAV有哪些血清型？如何选择合适的血清型？
现阶段已经发现的AAV有10多种血清型（AAV1/2/3/4/5/6/7/8/9/PHP.eB/PHP.B/PHP.S/rh10/DJ/2-retro）以及多种突变型。由于cap衣壳蛋白的氨基酸序列和空间结构的不同，识别与结合的细胞表面受体也有很大的差异，所以导致不同血清型AAV感染的细胞和组织类型和感染效率也各不相同。
文献中对各组织的AAV血清型感染能力可能存在不同结果，对于文献数据较少的靶组织，建议研究者用预实验测试确定最理想血清型，这也将是实验创新点之一。
细胞感染：AAVDJ（感染80%的细胞类型）和AAV6（感染血液来源的细胞）
客户定制服务项目（AAV载体构建）需要了解哪些信息？
① 客户是否有基因模板？如果有模板，需要测序验证之后提供给我们；
② 如果客户没有模板，需要合成基因？基因号、序列图谱、物种、基因长度；
③ 构建用什么启动子、需要添加什么标签或者荧光标记，是否要求几个基因共表达；
④ 注意AAV载体ITR之间的容量；
⑤ shRNA建议客户选择三个靶点，或者选择一个经过验证的靶点;我们帮忙设计的话，不保证感染效率，建议客户可以先用构建好的质粒在体外筛选一个最佳的感染靶点，再进行AAV病毒的包装。
AAV纯化的方法及QC检测指标有哪些？
派真生物采用碘克沙醇 密度梯度离心的方法进行纯化；
派真生物的QC检测指标：
① 纯度：通过跑SDS-PAGE考马斯亮蓝染色观察纯度；
② 滴度：派真生物用ATCC标准品做校正，用SYBR Green QPCR检测滴度，最后滴度可以达到1E+13GC/ml以上；
③ 内毒素检测：内毒素含量不超过10EU/ml;
④ TEM电镜（可选项目）：通过电镜观察空壳率（Empty/Full Ratio），低于30%以下；
⑤ HPLC（可选项目）：检测纯度；
⑥ 质谱分析（可选项目）：确定AAV血清型；
⑦ ddPCR检测滴度（可选项目）：没有标准品校正。
pH值测定是检测浓缩之前还是浓缩之后的pH？浓缩前后的pH是否会变化？如果是浓缩后，用pH计测定需要的样品量较多，是否会导致浪费？
pH值是rAAV成品放行必检项，如果希望节约样品，建议采用微量pH电极来实现，样品量一般仅需15uL-100uL。
装量怎么理解？
按照药典通则0942，最低装量检查法进行标示装量的检测。如有变动，建议与CDE沟通。
A260/A280反映的是DNA/蛋白的相对比值，它具体有什么意义？
A260/A280是DNA/蛋白的直观体现，对于rAAV而言，该指标可以侧面反映空壳率或者其他污染。当A260/A280过小，则空壳率可能偏高，当A260/A280过高，则其他污染可能过高。该方法的检测的优点是方便快捷，便于趋势跟踪。
一般来讲，蛋白杂质均来自宿主细胞和培养基，如果已经检测了宿主蛋白残留和BSA，再单独检测蛋白杂质又是基于什么考虑？
SDS-PAGE检测蛋白的目的是鉴别rAAV的衣壳蛋白条带，也能总体直观地反映蛋白杂质情况，除了宿主蛋白、BSA外，蛋白也可能是衣壳降解产物。
像rAAV这种非整合宿主基因组的病毒载体，如何检测感染滴度？
目前检验的金标准是采用TCID50，基本原理是基于辅助病毒adenovirus H5细胞实验再采用qPCR检测。
检测基因的表达和功能，考虑到之前已经用相同的质粒包rAAV完成体外实验和小鼠实验，所以这两项算是做过了，只要DNA序列正确，基因表达和功能检测可以不做吗 ？
基因表达跟工艺稳定性有关，也是属于效价（potency）的重要项。至于功能检测，建议与CDE沟通，从科学性角度做验证。
rcAAV是否指双链互补AAV？我的AAV非自身互补，不知检测该指标是基于什么考虑？
rcAAV是指复制完整型AAV（replication competent AAV），是对具有复制能力的AAV做残留限定，也是法规要求的重点项目，从评审的角度涉及安全性的检验项目是重点关注的项目。
不溶性微粒，不知这项中的不溶性微粒与外观可见异物和可见异物项目有何区别？
外观可见异物的检验方法是目测法，主要标准是无50μm以上异物，可见异物系指存在于注射剂、眼用液体制剂和无菌原料药中，在规定条件下目视可以观测到的不溶性物质，其粒径或长度通常大于50μm，此项目针对所有液体制剂【参引药典通则0904】。
不溶性微粒的检验方法通常采用不溶性微粒仪，关注的微粒范围为含10μm及以上的微粒。针对检查静脉用注射剂（溶液型注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液）及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量，可根据自己项目性质进行评估。【参引药典通则 0903】
对于支原体和细菌内毒素，是基于安评的考虑，之前已经做了两批小鼠实验，结果都没问题，这两项是否可以不做？
基因治疗国内法规参见CDE颁布《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》需进行该支原体、内毒素的检验。如有疑问，建议与中检院、CDE做沟通。
派真生物单次发酵的生产体积？对应的AAV产量是多少？
单次贴壁发酵体积：1L, 5L, 25L, 50L, 200L，均为单个反应器。不同AAV血清型和不同载体基因的产量可能不同，以AAV9（以中高产血清型为例）， 1L产量约1E+14GC，50L约1E+16GC，100L约2E+16GC，建议完成必要的工艺开发和批次稳定性验证。
Genome copy/mL（GC/mL）与 vg/mL（virus genome/mL）的单位是否具有换算关系？派真测定腺相关病毒GC/mL是采用何种方法？如果是q-PCR，是采用病毒自身特异引物，还是采用插入表达序列特异性引物？
enome copy/mL=gc/ml= vg/mL（virus genome/mL）。测定GC采用q-PCR和ddPCR两种方式。qPCR涉及标曲标准品的标定；ddPCR可以设置参比品质控，非必需项。ddPCR在精密度的验证上%RSD更低，特别是中间精密度。qPCR更容易存在实验室间与操作人员间的偏差。工艺摸索和中间品主要采用qPCR，终特色服务的滴度通常用ddPCR。GC方法开发可采用GOI靶基因的特异性引物，前期开发阶段也可采用polyA或者ITR等元件作为通用型检测。GMP特色服务建议用特异性引物，终特色服务滴度检验均基于特异性引物检验放行的。
对于包装生产的腺相关病毒成品，有否对空壳率进行测定，用什么方法，空壳率维持在一个什么样的水平？
通常采用AUC、TEM、CyroTEM、或者VG TITER/CAPSID TITER，但是AUC、TEM、CyroTEM不适合作为QC放行用，用于质量研究和工艺开发用会更好。目前采用阴离子色谱HPLC进行方法开发，派真可以提供分析方法开发服务并与CyroTEM、AUC检验结果进行比对验证。
空壳率每个血清型用柱层析得到的空壳率都有不同，派真生物生产AAV9可以通过工艺优化控制在10%以内的水平。
细胞库的检定是否按照中国药典2015三部通则《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》进行？
是的
通用检项中未见HIV，HBV，HCV检测，无热原质试验，野毒检测，这些是否需要检测，但是不属于通用检项？
特色服务收获液会根据工艺特性进行外源病毒因子检测，不列入原液和成品标准中。
目前分析方法可接受的误差或偏差范围？
一般生化类方法的%RSD通常为15%-25%，ddPCR接受标准为70%-130%，但通常验证数据为＜5%，TCID50的%RSD为小于100%。
对于批次送检的样本，有什么送样量的要求吗？
建议单次委托快递送样量不低于50uL体积，避免冻融、蒸发、管壁的影响。基因组滴度、质粒DNA残留、rcAAV等建议送样量10ul以上，感染滴度送样量建议20 ul以上，检测空壳率的送样量建议达到5×1013vg。