阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种常见的不可逆神经退行性疾病，全球患者数以千万计，且随年龄增长发病率不断攀升。传统干预手段大多聚焦于早期去除或抑制β淀粉样蛋白（Aβ）与Tau蛋白，却难以在中晚期挽救已大量丢失的神经元。
近期，暨南大学陈功教授团队与美国宾夕法尼亚州立大学研究者合作，在Advanced Science（IF=17.5）期刊上发表了题为“Brain-Wide Neuroregenerative Gene Therapy Improves Cognition in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease”的研究，报道了一种基于AAV脑全域递送的神经再生性基因疗法，可将内源性星形胶质细胞直接重编程为功能性神经元，并在AD小鼠中重建受损神经回路，大幅改善其认知表现。
一、研究背景
阿尔茨海默病的发病机制十分复杂，临床上普遍观察到患者大脑皮层与海马区神经元显著丢失，并伴随Aβ斑块、神经炎症等病理特征。尽管近年来针对Aβ清除的早期干预策略取得了一定进展，但对已进入中晚期、神经元大量死亡的患者疗效有限。如何“补足”大脑所丢失的神经元并重建完整的神经回路，成为阿尔茨海默病治疗亟待突破的关键。
在哺乳动物中，成体大脑内源性神经再生能力极其有限，而脑内数量庞大的星形胶质细胞则在理论上具备向神经元分化的潜能。科研人员近年来逐渐探索通过转录因子诱导的“星形胶质细胞-神经元”直接重编程（astrocyte-to-neuron conversion，简称AtN），以期在病灶原位生成新的神经元，替代和修复受损神经回路。本研究正是基于该思路，利用穿越血脑屏障（BBB）效果出色的AAV载体，实现了对整个大脑范围内的星形胶质细胞进行目的基因导入，并在阿尔茨海默病小鼠模型中观测到显著的神经元再生和认知恢复。
二、研究亮点
01.诱导星形胶质细胞向功能性神经元转分化
作者在星形胶质细胞中特异性表达转录因子NeuroD1后，观察到大量星形胶质细胞逐渐失去胶质标志物（GFAP、S100β）并获得成熟神经元标志物（NeuN），其细胞形态与电生理特征均与正常神经元相似。
2.单次全身给药，成功再生了约50万个神经元
通过先进的全脑荧光显微层析（fMOST）成像技术，作者定量分析了转换后生成的神经元总数：大脑皮层约36.6万，海马约14.9万，且绝大部分新生神经元整合进了局部神经环路。
3.神经再生带来明显的认知功能的恢复
研究人员使用嗅觉习惯化测试、Y迷宫、情景恐惧记忆、Morris水迷宫等多种行为学实验证实，在阿尔茨海默病5xFAD小鼠模型中，大范围星形胶质细胞向神经元转分化可显著改善学习记忆障碍。
三、主要研究结果
01.脑部广泛的神经再生
研究团队利用经过改造的AAV-PHP.eb载体，能高效穿透小鼠血脑屏障（BBB），直接将内源性星形胶质细胞（astrocytes）转化为功能性神经元。在AD小鼠模型中，这种基因疗法成功再生了约50万个新神经元，这些新神经元广泛分布于大脑皮层和海马区域（文章图5）。
文章图5 AtN全脑成像与电生理学研究。A) 示意图展示了用于fMOST成像的小鼠脑组织收集和制备过程。B) fMOST全脑成像流程：树脂包埋的脑组织沿前后方向切片，每层厚度为2微米。C) fMOST全脑GFP荧光成像的代表性图像。其中，绿色、紫色和青色分别代表大脑皮层、海马和小脑。D) 使用Imaris软件从全脑图像中提取皮层（绿色）和海马（紫色）结构，以便进行进一步的独立分析。E) 矢状面（厚度100微米）的3D透明视图，白色框标示了皮层（MO、SS和VIS）和海马（CA1）中的一些典型脑区。MO：运动皮层；SS：体感皮层；VIS：视觉皮层；CA1：阿蒙角1区。F) 单层fMOST荧光图像（GFP）的代表性高倍图像。G) 通过共聚焦图像验证Imaris软件识别转化神经元（GFP+和NeuN+）的准确性，蓝色斑点表示Imaris软件识别的转化神经元。H) 统计数据显示，Imaris软件识别转化神经元的准确率约为90%。I) Imaris软件在fMOST荧光图像中自动识别星形胶质细胞转化神经元（GFP+，蓝色斑点标记）的示例。J) 定量结果显示，NeuroD1在皮层和海马中分别诱导了36600和14900个星形胶质细胞转化神经元（n=4只小鼠）。K-M) 位于皮层（上）和海马（下）的转化神经元的代表性记录，包括诱发的重复动作电位（K）、自发兴奋性突触后电流（sEPSCs，L）和抑制性突触后电流（sIPSCs，M）。N) sEPSCs的平均频率和幅度的汇总图。O) sIPSCs的平均频率和幅度的柱状图。
02.新神经元的功能整合
转化的神经元能够整合到现有的神经网络中，并改善AD小鼠的各种认知表现。通过电生理学实验，研究人员发现这些新神经元能够形成突触连接，并表现出自发的兴奋性和抑制性突触后电流（sEPSCs和sIPSCs），表明它们已经成功地融入了神经网络（文章图5）。
03.多个脑区均发生重编程，但程度存在区域差异
研究还发现，不同脑区的星形胶质细胞在NeuroD1介导的转化过程中表现出异质性：
● 在大脑皮层和海马区域，星形胶质细胞能够高效转化为神经元，而在嗅球、丘脑和脑干等区域转化效率较低。
● 转化的神经元表现出区域特异性的分子特征，例如在皮层中主要转化为表达Cux1（浅层标记）和Ctip2（深层标记）的神经元，在海马中则主要转化为表达Ctip2和Prox1的神经元。
04.认知功能的显著改善
在多种行为测试中，接受基因疗法的AD小鼠表现出显著的认知功能改善（文章图7）：
- Y迷宫测试：接受治疗的雄性AD小鼠在空间工作记忆方面表现出显著改善。
- 气味习惯化测试：AD小鼠的气味记忆障碍被显著改善。
- 情境恐惧条件化测试：基因疗法显著改善了AD小鼠的恐惧记忆。
- Morris水迷宫测试：接受治疗的AD小鼠在空间学习和记忆方面表现出显著改善。
文章图7. 脑部广泛的星形胶质细胞到神经元（AtN）基因疗法改善了5xFAD小鼠的认知功能。A) 行为实验时间轴。双转基因小鼠在6-6.5个月龄时接受了AAV-PhP.eB（眼眶后注射）。在AAV-PhP.eB注射后2个月进行了行为测试。B,C) Y迷宫测试显示，在自发交替Y迷宫测试中，与野生型（WT）小鼠相比，5xFAD雄性（n=11，图B）和雌性（n=18，图C）小鼠的空间工作记忆显著受损。与GFP对照组相比，通过AAV-PhP.eB介导的NeuroD1基因疗法改善了雄性（n=13，图B）5xFAD小鼠的自发交替行为。D,E) 小鼠对相同气味重复呈现的调查时间的标准化值。在NeuroD1治疗后，雄性（WT，n=10；5xFAD，n=9；5xFAD+GFP，n=13；5xFAD+ND1，n=14，图D）和雌性（WT，n=9；5xFAD，n=13；5xFAD+GFP，n=10；5xFAD+ND1，n=10，图E）5xFAD小鼠的嗅觉记忆显著改善。F,G) 雄性（n=11，图F）和雌性（n=15，图G）5xFAD小鼠表现出情境恐惧条件化记忆受损，但通过NeuroD1介导的脑部广泛AtN基因疗法显著改善了雄性（n=13，图F）和雌性（n=15，图G）5xFAD小鼠的恐惧记忆。H) 在Morris水迷宫的空间训练中，到达隐藏平台的潜伏期。与WT小鼠（n=17）相比，5xFAD小鼠（n=17）找到隐藏平台的时间更长（p < 0.02，单因素方差分析结合Fisher LSD检验）。值得注意的是，经过NeuroD1治疗的5xFAD小鼠（n=21）比对照组（n=18）更快找到隐藏平台。I) 在探测试验中穿过平台的次数（WT，n=17；5xFAD，n=17；5xFAD+GFP，n=18；5xFAD+ND1，n=21）。J) 在探测试验中在目标象限中度过的时间（WT，n=17；5xFAD，n=17；5xFAD+GFP，n=18；5xFAD+ND1，n=21）。
05.转化神经元的必要性
通过化学遗传学（chemogenetic）方法特异性抑制转化神经元的活动，研究人员发现这种抑制会消除AD小鼠的记忆改善效果，这表明新转化的神经元在认知恢复中起着关键作用。
文章图8化学遗传学证据表明，星形胶质细胞转化的神经元对5xFAD小鼠记忆改善有贡献。A) hM4Di-mCherry AAV-PhP.eB的工作模型，采用Cre-on策略。使用hSyn启动子特异性地在神经元中驱动hM4Di的表达。B) 通过眼眶后注射（R.O.）将AAV-PhP.eB-FLEx-CAG::GFP和FLEx-hSyn::hM4Di-mCherry或AAV-PhP.eB-FLEx-CAG::NeuroD1-P2A-GFP和FLEx-hSyn::hM4Di-mCherry的混合物注入双转基因小鼠体内。由于Cre-on和hSyn启动子的双重控制，只有星形胶质细胞转化的神经元能够表达hM4Di。C) 典型共聚焦图像显示，在AAV注射后2个月，对照组中星形胶质细胞和原有神经元均未表达hM4Di。D) 代表性图像显示，在AAV注射后2个月，hM4Di在转化的神经元（GFP+，箭头）中特异性表达，但在原有神经元中不表达。E) 星形胶质细胞转化的神经元中hM4Di的定量数据。F) 星形胶质细胞转化的神经元在CNO灌注（5μM）前后的诱发动作电位轨迹。G–I) 左侧：在皮层（G，n=5）、CA1（H，n=6）和齿状回转化的神经元（I，n=6）中，CNO（5μM）处理后，诱发动作电位（APs）所需的最小注入电流增加。右侧：在不同注入电流下，皮层（G，n=5）、CA1（H，n=6）和齿状回转化的神经元中诱发的APs数量。J) 化学遗传学实验设计的示意图（上）和机制（下），结果表明在AAV-PhP.eB注射后2个月，星形胶质细胞转化的神经元直接促进了5xFAD小鼠恐惧条件化记忆的改善。K) 对照组小鼠和接受NeuroD1治疗的小鼠在接受生理盐水或CNO（5 mg/kg）腹腔注射后的冻结时间百分比的定量分析。
四、研究结论
本研究首次在阿尔茨海默病动物模型中验证了“脑全域式”基因递送所实现的星形胶质细胞到神经元转分化策略。通过NeuroD1关键转录因子的稳定表达，研究人员在AD小鼠海马和大脑皮层内再生出大量成熟且功能完备的神经元，并且这些新生神经元在行为学测试中表现出改善记忆和学习的能力。更重要的是，后续的化学遗传学抑制结果证明，这些新生成的神经元对AD小鼠的认知功能提升发挥了至关重要的直接作用。
五、展望与意义
01.为中晚期AD治疗带来新思路
传统以降低Aβ为主要目标的疗法，在神经元严重丢失的中晚期AD患者中往往无能为力。本研究证明，利用星形胶质细胞重编程为新神经元，确有望弥补这些“空缺”。如果这一策略在人类患者中验证成功，将大大拓展AD甚至其他神经退行性疾病的治疗可能性。
02.AtN转分化技术安全性与特异性仍需进一步验证
尽管动物实验结果令人振奋，但将神经再生性基因疗法推向临床，还需更多关于安全性、稳定性及给药剂量调控的深入研究。是否会引发异常放电、异常再生或免疫排斥等潜在问题，均是今后必须关注的课题。
03.跨血脑屏障AAV载体未来或可应用于更多脑病场景
本研究显示，改造后的AAV-PhP.eB具备在小鼠全脑范围内高效率递送外源基因的能力，这意味着针对其他脑区广泛受损或弥漫性病变（如帕金森病、弥漫性胶质瘤等）的基因治疗也有可能开展新一轮探索。
派真有幸为本研究部分实验提供了AAV载体定制与包装服务。本研究中用到的AAV病毒载体和注射方式如下：
